Crazyvirus战友请看过来，关于转染
丁香园论坛
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收到你的邮件，得知你做转染遇到一些麻烦，看看这个有帮助吗？
1。转染方法：有大量的技术和试剂用于将大分子转导至真核细胞中。这些大分子与胞内的组分反应，从而导致基因表达、蛋白质合成、细胞分化的诱导或抑制、细胞形态的改变、细胞的无限增殖或恶性转化。针对不同转染实验的各种目的和要求，没有任何一种方法或试剂对于所有的大分子转导都是最佳的。
既然可以象转导蛋白质和小分子一样将DNA，RNA和寡聚核苷酸转导到各种细胞中，本手册将着重于如何将核酸转导至真核细胞。目前，有两种不同的方法被应用：
转染—— 在这一过程中通过生化或者物理方法将目的基因导入真核细胞中。
感染—— 通过病毒介导，用基因组中携带有克隆目的片段的病毒来感染靶细胞。
通过感染转导DNA比转染的方法更复杂。一般来说，感染步骤烦琐，时间较长，而且视所使用的病毒，还会产生生物安全性的问题。在敏感细胞系中病毒感染效率高，而在缺少病毒受体的细胞系中感染效率很低或者无感染。然而，通过转染来转导DNA更快，而且只需几种材料，包括含有在强启动子调控下的目的基因的质粒DNA。由于其简便和诸多提高效率的优点，使得转染成为一种应用更为广泛的方法。
核酸转染技术
转染技术的目的是研究真核基因的表达和调控。目前的方法包括磷酸钙共沉淀法，电穿孔法以及同DEAE-dextran或阳离子脂质体试剂形成复合物法。在这些不同的方法中，DNA转导的效率，转导的机制，可重复性及使用的方便性都存在差异。而且，有效的DNA转导会伴随某些毒性或细胞抑制，程度依赖于试剂、步骤和目的细胞的不同而不同，因此建议每种技术都应优化以得到最佳结果。下面就对转染技术做简要叙述。
磷酸钙共沉淀
将氯化钙，DNA和磷酸缓冲液混合，沉淀形成包含DNA且极小的不溶的磷酸钙颗粒。磷酸钙-DNA复合物粘附到细胞膜并通过胞饮进入目的细胞的细胞质。沉淀物的大小和质量对于磷酸钙转染的成功至关重要。在实验中使用的每种试剂都必须小心校准，保证质量，因为甚至偏离最优条件十分之一个pH都会导致磷酸钙转染的失败。
电穿孔法
电穿孔通过将细胞暴露在短暂的高场强电脉冲中转导分子。将细胞悬浮液置于电场中会诱导沿细胞膜的电压差异，据认为这种电压差异会导致细胞膜暂时穿孔。电脉冲和场强的优化对于成功的转染非常重要，因为过高的场强和过长的电脉冲时间会不可逆地伤害细胞膜而裂解细胞。一般，成功的电穿孔过程都伴随高水平（50%或更高）的毒性。
DEAE-葡聚糖和polybrene
带正电的DEAE-葡聚糖或polybrene多聚体复合物和带负电的DNA分子使得DNA可以结合在细胞表面。通过使用DMSO或甘油获得的渗透休克将DNA复合体导入。两种试剂都已成功用于转染。DEAE-葡聚糖仅限于瞬时转染。
机械法
转染技术也包括使用机械的方法，比如显微注射和基因枪（biolistic particle）。显微注射使用一根细针头将DNA，RNA或蛋白直接转入细胞质或细胞核。基因枪使用高压microprojectile将大分子导入细胞。
阳离子脂质体试剂
在优化条件下将阳离子脂质体试剂加入水中时，其可以形成微小的（平均大小约100-400nm）单层脂质体。这些脂质体带正电，可以靠静电作用结合到DNA的磷酸骨架上以及带负电的细胞膜表面。因此使用阳离子脂质体转染的原理与以前利用中性脂质体转染的原理不同。使用阳离子脂质体试剂，DNA并没有预先包埋在脂质体中，而是带负电的DNA自动结合到带正电的脂质体上，形成DNA-阳离子脂质体复合物。据称，一个约5kb的质粒会结合2-4个脂质体。被俘获的DNA就会被导入培养的细胞。现存对DNA转导原理的证据来源于内吞体和溶酶体。
2。转染方法学的选择：转染效率并非唯一标准：（invitrogen的广告)
在评价将DNA瞬时导入细胞中的转染试剂和方法时，我们已经明确转染效率并非是唯一标准。我们评估了4种转染试剂和电激转染法。利用磷脂酶（PLC）分析来测定细胞膜表明这些方法对细胞膜功能有显著的不同影响。因为其他方法造成细胞膜PLC分析结果有较大变化，LIPOFECTAMINETM试剂成为转染方法的选择。简而言之：不仅是转染效率，瞬时转染的功能分析也必须计入。
将重组的基因转入动物细胞并表达是确定和分析功能基因产物的有力手段。为了介导重组基因向细胞中转化，已经发展了多种具有转染多种细胞系的能力和不同的转染效率的产品。我们的研究包括确定和描述了7个与已知的化学引诱物受体，例如N-甲酰多肽受体，密切相关的转膜区受体。作为一个例子，N-甲酰多肽受体（fMLF-R）是视紫红素超家族的一员，当配体（f-Met-Leu-Phe）与其特异结合时通过百日咳毒素敏感的GTP-结合蛋白介导信号传导。为了通过功能分析检验配体结合，重组基因置于一个表达载体中并与一个表达GTP-结合蛋白，例如：Gα15或Gα16，的质粒共转染。这些GTP-结合蛋白介导多种受体的信号传导，是筛选同种和孤立的受体的策略，并已被证实在N-甲酰多肽受体，例如C5a过敏毒素和fMLF-R，的信号传导功能分析中是很有用的。如果转染的cDNA编码一个可结合配体的受体，然后再与Gα16（或Gα15）联合会导致3H-肌醇结合到三磷酸肌醇中，它的相对水平可用PLC分析来评定。
本实验室在优化PLC分析时，我们检验了多种转染试剂和方法。因为COS-7细胞相对较容易转染，用各种试剂和方法均获得中等到较高的转染效率。然而，我们发现转染方法可以影响PLC分析。这表明转染效率并非转染试剂和方法选择的唯一标准，而进行瞬时转染分析时细胞的功能也必须评价。
1。转染方法：有大量的技术和试剂用于将大分子转导至真核细胞中。这些大分子与胞内的组分反应，从而导致基因表达、蛋白质合成、细胞分化的诱导或抑制、细胞形态的改变、细胞的无限增殖或恶性转化。针对不同转染实验的各种目的和要求，没有任何一种方法或试剂对于所有的大分子转导都是最佳的。
既然可以象转导蛋白质和小分子一样将DNA，RNA和寡聚核苷酸转导到各种细胞中，本手册将着重于如何将核酸转导至真核细胞。目前，有两种不同的方法被应用：
转染—— 在这一过程中通过生化或者物理方法将目的基因导入真核细胞中。
感染—— 通过病毒介导，用基因组中携带有克隆目的片段的病毒来感染靶细胞。
通过感染转导DNA比转染的方法更复杂。一般来说，感染步骤烦琐，时间较长，而且视所使用的病毒，还会产生生物安全性的问题。在敏感细胞系中病毒感染效率高，而在缺少病毒受体的细胞系中感染效率很低或者无感染。然而，通过转染来转导DNA更快，而且只需几种材料，包括含有在强启动子调控下的目的基因的质粒DNA。由于其简便和诸多提高效率的优点，使得转染成为一种应用更为广泛的方法。
核酸转染技术
转染技术的目的是研究真核基因的表达和调控。目前的方法包括磷酸钙共沉淀法，电穿孔法以及同DEAE-dextran或阳离子脂质体试剂形成复合物法。在这些不同的方法中，DNA转导的效率，转导的机制，可重复性及使用的方便性都存在差异。而且，有效的DNA转导会伴随某些毒性或细胞抑制，程度依赖于试剂、步骤和目的细胞的不同而不同，因此建议每种技术都应优化以得到最佳结果。下面就对转染技术做简要叙述。
磷酸钙共沉淀
将氯化钙，DNA和磷酸缓冲液混合，沉淀形成包含DNA且极小的不溶的磷酸钙颗粒。磷酸钙-DNA复合物粘附到细胞膜并通过胞饮进入目的细胞的细胞质。沉淀物的大小和质量对于磷酸钙转染的成功至关重要。在实验中使用的每种试剂都必须小心校准，保证质量，因为甚至偏离最优条件十分之一个pH都会导致磷酸钙转染的失败。
电穿孔法
电穿孔通过将细胞暴露在短暂的高场强电脉冲中转导分子。将细胞悬浮液置于电场中会诱导沿细胞膜的电压差异，据认为这种电压差异会导致细胞膜暂时穿孔。电脉冲和场强的优化对于成功的转染非常重要，因为过高的场强和过长的电脉冲时间会不可逆地伤害细胞膜而裂解细胞。一般，成功的电穿孔过程都伴随高水平（50%或更高）的毒性。
DEAE-葡聚糖和polybrene
带正电的DEAE-葡聚糖或polybrene多聚体复合物和带负电的DNA分子使得DNA可以结合在细胞表面。通过使用DMSO或甘油获得的渗透休克将DNA复合体导入。两种试剂都已成功用于转染。DEAE-葡聚糖仅限于瞬时转染。
机械法
转染技术也包括使用机械的方法，比如显微注射和基因枪（biolistic particle）。显微注射使用一根细针头将DNA，RNA或蛋白直接转入细胞质或细胞核。基因枪使用高压microprojectile将大分子导入细胞。
阳离子脂质体试剂
在优化条件下将阳离子脂质体试剂加入水中时，其可以形成微小的（平均大小约100-400nm）单层脂质体。这些脂质体带正电，可以靠静电作用结合到DNA的磷酸骨架上以及带负电的细胞膜表面。因此使用阳离子脂质体转染的原理与以前利用中性脂质体转染的原理不同。使用阳离子脂质体试剂，DNA并没有预先包埋在脂质体中，而是带负电的DNA自动结合到带正电的脂质体上，形成DNA-阳离子脂质体复合物。据称，一个约5kb的质粒会结合2-4个脂质体。被俘获的DNA就会被导入培养的细胞。现存对DNA转导原理的证据来源于内吞体和溶酶体。
2。转染方法学的选择：转染效率并非唯一标准：（invitrogen的广告)
在评价将DNA瞬时导入细胞中的转染试剂和方法时，我们已经明确转染效率并非是唯一标准。我们评估了4种转染试剂和电激转染法。利用磷脂酶（PLC）分析来测定细胞膜表明这些方法对细胞膜功能有显著的不同影响。因为其他方法造成细胞膜PLC分析结果有较大变化，LIPOFECTAMINETM试剂成为转染方法的选择。简而言之：不仅是转染效率，瞬时转染的功能分析也必须计入。
将重组的基因转入动物细胞并表达是确定和分析功能基因产物的有力手段。为了介导重组基因向细胞中转化，已经发展了多种具有转染多种细胞系的能力和不同的转染效率的产品。我们的研究包括确定和描述了7个与已知的化学引诱物受体，例如N-甲酰多肽受体，密切相关的转膜区受体。作为一个例子，N-甲酰多肽受体（fMLF-R）是视紫红素超家族的一员，当配体（f-Met-Leu-Phe）与其特异结合时通过百日咳毒素敏感的GTP-结合蛋白介导信号传导。为了通过功能分析检验配体结合，重组基因置于一个表达载体中并与一个表达GTP-结合蛋白，例如：Gα15或Gα16，的质粒共转染。这些GTP-结合蛋白介导多种受体的信号传导，是筛选同种和孤立的受体的策略，并已被证实在N-甲酰多肽受体，例如C5a过敏毒素和fMLF-R，的信号传导功能分析中是很有用的。如果转染的cDNA编码一个可结合配体的受体，然后再与Gα16（或Gα15）联合会导致3H-肌醇结合到三磷酸肌醇中，它的相对水平可用PLC分析来评定。
本实验室在优化PLC分析时，我们检验了多种转染试剂和方法。因为COS-7细胞相对较容易转染，用各种试剂和方法均获得中等到较高的转染效率。然而，我们发现转染方法可以影响PLC分析。这表明转染效率并非转染试剂和方法选择的唯一标准，而进行瞬时转染分析时细胞的功能也必须评价。
