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【共享】质粒的大量抽提方法,抽提的质粒的质量和浓度都不错

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这种方法抽提的质粒质量和浓度都不错,是我们实验室根据标准方法改进后总结出来的,和大家共享,希望能加点分。

1、  前一天晚上将要抽提的菌种接种一单菌落到盛有100mL 液体培养基的500mL三角瓶中,于37℃,250rpm摇床培养过夜。
2、  将此培养液转移至2个50mL离心管中,5000rpm离心10分钟,弃上清液。
3、  向2个离心管中各加5mL SolI,剧烈振荡使菌体尽可能均匀重悬。
4、  向2个离心管中各加10mL SolII,轻轻颠倒离心管,使液体尽可能混合均匀。
5、  向2个离心管中各加7.5mL SolIII,轻轻颠倒离心管,使内容物沉淀,并于冰上放置30min以上。
6、  以5000rpm离心15min,然后用擦镜纸过滤至干净的50mL离心管中。
7、  向2个离心管中各加入12mL的异丙醇,颠倒离心管使混匀,并于冰上放置30min以上。
8、  以6000rpm离心15min,弃上清液,每个50mL 离心管中的沉淀用2mL TE(pH 8.0)溶解并转移到1个5mL离心管中。
9、  向2个5mL离心管中各加入2mL 5mol/L LiCl 溶液,振荡使混匀,于冰上放置片刻,8000rpm离心15min。
10、每个5mL离心管中的上清液转移到2个干净的5mL离心管中,向各管中加入等体积的异丙醇,于冰上放置片刻,以8000rpm离心15min,弃上清液。
11、用50μL 50μg/mL的Rnase TE(8.0)溶液溶解每管中的沉淀,合并各管中液体,转移到一干净的1.5mL离心管,并于37℃水浴30min以上。
(此步之后可将质粒存放于-70℃冰箱,第二天接着纯化)
12、向各管质粒溶液中加入450μL的13% PEG8000 1.6mol/L NaCl 溶液,于冰上放置片刻,12000rpm离心10min,弃上清液。
13、每管中加入400μL的TE(pH8.0)液溶解沉淀,然后加入1mL酚氯仿,剧烈振荡均匀,于冰上静置片刻,以12000rpm离心10min。(若界面蛋白沉淀较多,可再用酚氯仿抽提一次)
14、小心吸取上清液至干净的1.5mL 离心管,敞开管口,55℃水浴30min左右使有机溶剂挥发。
15、向每管加入800μL的无水乙醇,振荡混合均匀,并于冰上放置片刻,然后以12000rpm离心15min,弃上清液。
16、向每管加入1mL 70%乙醇洗涤,离心并弃上清液。
17、敞开离心管口,于室温放置10min左右,使多余的乙醇挥发。
18、向每管加入200~500μL TE(pH8.0)溶解质粒,于-20℃贮存。
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