RNAi 和DNA芯片的结合
丁香园论坛
2033
尽管研究基因组的技术已经相当先进，科学家们还在致力不断的创新和改造技术使之更为强大。现代分子生物学两个划时代的技术——DNA芯片和RNAi (RNA-mediated interference) ，正在掀开生物医药的新篇章。
RNAi，通过双链RNA引发目标靶基因沉默的一项强大的新技术，专一性强，可大规模操作，重复性高，应用前景极为广阔。
另一方面，DNA芯片技术可以提供特定条件下一个细胞中所有基因表达情况的全景图，同样具有无可比拟的优势。那么这两种技术结合起来会怎么样？在信号传导通路研究方面有着丰富的经验，来自纽约冷泉港实验室癌症基因组研究中心助教授Vivek Mittal, PhD，目前正在致力于这方面的研究。他已经成功利用DNA芯片对癌症和肿瘤的血管生成进行全基因组范围的转录水平的分析检测。
Mittal希望DNA芯片技术和RNAi技术结合起来，成为更强大的技术，从而更系统深入了解整个基因相互作用网络的完整的“全景图”。由于采用RNAi技术可以在任何时候，或者某一次“关闭”一个基因的表达，然后利用DNA芯片技术全面了解每次干扰的后果——关闭一个基因的表达，或者下调基因的表达水平会导致哪些基因表达发生哪些变化，这样就可以了解这个基因参与的某些信号通路的相关信息。然后再关闭另一个基因，了解干扰的后果，不断的重复这样的工作，直到能从这些结果中总结出一个新的模式。Mittal就按照这个思路，采用RNAi技术作为反式遗传工具，系统的干扰基因表达，然后用DNA 芯片技术了解每次干扰所引起的基因表达模式的差异来开展对血管生成调控机制进行研究。
Mittal 在CSHL读博士后的时候主要研究哺乳动物细胞中核仁小分子RNA（small nuclear RNA，snRNA）基因的转录调控机制，特别是转录如何发生的具体细节。Mittal 在研究转录的时候，DNA 芯片技术方兴未艾，Mittal 于是想到，为什么要一次专注研究一个基因，而不是在全基因组范围内研究转录调控？
正好这个时候Michael Wigler在CSHL用DNA芯片研究癌症中基因的扩增。Mittal 对基因的表达非常感兴趣，跟着Wigler一年，很快CSHL给Mittal 自己的实验室开展DNA芯片的研究。Mittal 的实验室现在有几个独立的项目，其中之一是用RNAi技术和DNA 芯片技术研究Id介导的血管生成通路。他们的目标是鉴别出Id 基因相互作用网络中的成员，分析它们的活性机制，确认它们在肿瘤生成发展过程中的产生的影响。他们正在系统的采用RNAi介导基因表达抑制结合DNA芯片检测全局基因表达图谱的方法，将两个强大的技术结合起来，再加上功能分析，从而将Id基因调控通路的每个细节研究出来。
在肿瘤中描绘血管生成通路
这个Id转录因子基因家族包括Id1, Id2, Id3, 和Id4。它们是细胞周期调控、细胞分化等几个关键细胞进程的重要调控因子，也和血管生成和一系列癌症的失控有关。在成年人中Id1和Id3专一的在肿瘤血管内皮中表达，Id1或者是Id3缺失的小鼠模型中肿瘤不能生长或者转移。因此，Id和其下游目标底物有可能成为抗血管生成药物治疗的理想目标。
然而，说的容易做起来难。想确定哪个特定蛋白作为用药目标并不是那么容易的，所以研究人员需要先研究Id特异的信号通路来确定几个候选蛋白。好在Id1和Id3只在肿瘤血管中表达而不会在其他正常血管中表达。
通过和其他实验室的合作，Mittal的实验室采用 cDNA 芯片，生物信息学，RNAi技术和小鼠肿瘤模型来鉴别Id的目标靶，研究内皮细胞中的Id 通路。他们发现，肿瘤内皮细胞缺失Id1会导致a6和b4整合素，基质金属蛋白酶2 (matrix metalloproteinase-2 MMP-2)，成纤维细胞生长因子受体1的表达下调，同时在体内血管生成时抑制这些因子的表达会表现出Id基因缺失的拟表型。以往的实验结果也表明这些成员可能共同参与某些传导通路，比如bFGF在内皮细胞中上调整合素a6和b4，而MMP-2通过切割调控层粘连蛋白laminin-5（已知是a6b4 integrin的配体）来刺激表皮细胞的迁移。
因此，如果同样的通路确实在内皮细胞中发挥作用，那么Id 的缺失可能会由于下调这个通路中的3种重要的成员而缩短这个通路。这个研究展示了功能基因组学方法加上小鼠肿瘤模型如何作为一种新的手段应用于研发抗血管生成治疗药物。他们找到了新的基因，现在正在用RNAi技术对这个Id 基因网络作系统性研究。这种研究方法可以用在其他疾病模型的功能性分析上。
识别有效的RNAi探针
CSHL研究RNAi有一段历史了。有不少卓越的科学家和Mittal一起研究RNAi进展。Gregory Hannon教授曾经说过“激起对RNAi如此大的兴趣，正是由于RNAi确实有效”。研究人员采用RNAi技术已经超过2年，这项技术显然一直正常而有效的在研究系统中发挥作用。
著名的《Science》杂志评选2002年重大成就时表彰了Hannon, Shiv Grewal和 Rob Martienssen教授对RNAi机制和特性的深入研究，特别是RNAi和染色质结构的非遗传调控（epigenetic regulation）之间的关系。但是尽管有着如此多老练的科学家在进行研究，RNAi还是存在不少未知的空间。例如，尽管RNAi是如此强有力的一种研究哺乳动物细胞基因功能的工具，但是RNAi技术一直存在一个很大的难题：显然还缺少一种可靠的筛选RNAi靶位点的方法。就是说RNAi技术在哺乳动物细胞中的应用，一个难题是检测哪种RNAi探针能够最有效的抑制基因的表达。研究人员往往要根据一个基因不同区域制备5—6种RNAi探针，这样就严重限制了RNAi作为一种通用的基因功能分析工具在哺乳动物系统的广泛应用。
Mittal的实验室开发了一种能够针对任意基因快速鉴别有效的小分子干扰RNA(small interfering RNAs, siRNAs)或者是短发夹结构RNA(short hairpin RNA)探针的半定量方法。这种方法包括：通过检测RNA探针是否能够关闭一个特殊表达的嵌合了目的基因和报告基因的mRNA中的同源序列来有效鉴别RNA探针。通过一个荧光或者是酶类报告基因，siRNA 的效果可以被定量检测。Mittal的实验室检测了多个具有不同生理功能的基因，证实了siRNA 探针对嵌合了目的基因和报告基因的嵌合mRNA的抑制作用和对同源的内源目的基因的抑制作用是正相关的。
Mittal改造了一种基于微阵列的细胞转染方法，这种方法是以前由 Whitehead Institute for Biomedical Research, Cambridge, Mass.的科学家研究出来的，作为高通量平行实验中一种筛选有效的RNAi探针的平台。Mittal将这种基于微阵列的细胞转染成为RNAi芯片，并证实这种方法可以进行修改从而使之适应高通量筛选鉴别合适的RNAi探针——将探针点在DNA芯片上然后在玻璃片上面直接转染。
Mittal 认为：鉴别出能使某个基因沉默的有效siRNA，不仅对基础研究，同时也对基于RNAi的基因治疗和遗传工程修饰的动物模型都将产生重大影响。在这个领域过去的两年中，每隔半年就有一个令人吃惊的新发现，人们仍不清楚这种生理现象的功能和范围。当研究人员进一步掌握RNAi的作用机制时，我们就可以更好的了解RNAi的限制，同时也就能更好的设计更有效的抑制基因表达的东西。
干细胞的可塑性
深入了解干细胞在响应微环境变化时如何决定其最终分化方向的机制也是Mittal这个小组的另一个研究课题。他们试图了解在分化过程中那些基因的表达发生了变化。于是他们构建了特殊的转基因小鼠——小鼠的干细胞做了如下标记：有一个由干细胞启动子引导的绿色荧光蛋白，同时干细胞中还带有一个由分化细胞专一活性的启动子引导的红色荧光蛋白。通过不同的实验检验其荧光特征，随后进行芯片分析，这将帮助解开在细胞分化过程中那些基因表达发生和、变化是至关重要的。鉴别不同的分化通路将使得研究人员可以在体外控制干细胞的分化。干细胞移植被认为在减轻例如肌肉萎缩症，帕金森氏综合症和其他退行性病变的治疗中有重要的应用前景。
有关血管生成的一些背景细节：
Vivek Mittal, 针对血管生成中Id介导的信号通路的研究将有助于他们进一步开发开血管生成药物。什么是血管生成？这是指机体内一个重要的自然进程——新血管的生成。在健康的机体内这个进程通常发生在各种程度的伤口愈合，通常是由一系列的开关控制。“开”是指促进血管生成的生长因子，“关”则主要是血管生成的抑制因子。下面是一些最新的相关研究进展
Diseased or injured tissues produce and release angiogenic growth factors (proteins) that diffuse into the nearby tissues.
The angiogenic growth factors bind to specific receptors located on the endothelial cells of nearby preexisting blood vessels.
Once growth factors bind to their receptors, the endothelial cells become activated and signals are sent from the cell's surface to the nucleus. The endothelial cell's machinery then begins to produce new molecules including enzymes, which dissolve tiny holes in the sheath-like covering surrounding all of the existing blood vessels.
The endothelial cells divide and migrate out through the dissolved holes of the existing vessels toward the diseased tissue (tumor).
Specialized adhesion molecules, or integrins, help to pull the sprouting new blood vessels forward.
Enzymes such as matrix metalloproteinases are produced to dissolve the tissue in front of the sprouting vessel tip in order to accommodate it. As the vessel extends, the tissue is remolded around the vessel.
The sprouting endothelial cells roll up to form a blood vessel tube, which connect to form blood vessel loops that can then circulate blood.
Newly formed blood vessels are stabilized by specialized muscle cells that provide structural support and blood flow begins.
(Source: The Angiogenesis Foundation)
Name: Vivek Mittal
Title: Assistant professor, Cancer Research Genome Center, Cold Spring Harbor Laboratory
Web site: http://www.cshl.org
Education: PhD/Jawaharlal Nehru University, New Delhi, India, 1994; MS/Jawaharlal Nehru University, 1988; BS/St. Joseph's College, North Point, Darjeeling, India, 1985.
Current research: Technology development pertaining to DNA microarrays; use of DNA arrays in genome-wide analysis of cancer and tumor angiogenesis; design and implementation of informatics tools for analysis of array data.
制作RNAi芯片和应用于高通量筛选RNAi探针
左图：示意图显示生产和分析一块RNAi芯片的过程。两个质粒，一个编码目的基因-EGFP（加强型绿色荧光蛋白）融合基因，另一个编码RFP(红色荧光蛋白)作为内对照，连同各种RNAi探针一起被点在芯片上，然后和哺乳动物细胞一起培养，只有在最靠近DNA点附近的细胞会被转染，生长成明显不同的细胞群。用激光扫描仪进行检测每个细胞群的EGFP和RFP的荧光强度，并用分析软件对每个点的荧光强度进行定量。
右上图：激光扫描图象显示表达EGFP 和RFP的情况。右下图：RNAi芯片显示一个有效的EGFP特异的RNAi探针抑制EGFP而不是RFP的表达。一个非特异的探针不影响两个基因的表达。结果显示一个RNAi探针的特异性。这个方法可以用于有效的识别各种不同基因的最有效的RNAi探针。
RNAi，通过双链RNA引发目标靶基因沉默的一项强大的新技术，专一性强，可大规模操作，重复性高，应用前景极为广阔。
另一方面，DNA芯片技术可以提供特定条件下一个细胞中所有基因表达情况的全景图，同样具有无可比拟的优势。那么这两种技术结合起来会怎么样？在信号传导通路研究方面有着丰富的经验，来自纽约冷泉港实验室癌症基因组研究中心助教授Vivek Mittal, PhD，目前正在致力于这方面的研究。他已经成功利用DNA芯片对癌症和肿瘤的血管生成进行全基因组范围的转录水平的分析检测。
Mittal希望DNA芯片技术和RNAi技术结合起来，成为更强大的技术，从而更系统深入了解整个基因相互作用网络的完整的“全景图”。由于采用RNAi技术可以在任何时候，或者某一次“关闭”一个基因的表达，然后利用DNA芯片技术全面了解每次干扰的后果——关闭一个基因的表达，或者下调基因的表达水平会导致哪些基因表达发生哪些变化，这样就可以了解这个基因参与的某些信号通路的相关信息。然后再关闭另一个基因，了解干扰的后果，不断的重复这样的工作，直到能从这些结果中总结出一个新的模式。Mittal就按照这个思路，采用RNAi技术作为反式遗传工具，系统的干扰基因表达，然后用DNA 芯片技术了解每次干扰所引起的基因表达模式的差异来开展对血管生成调控机制进行研究。
Mittal 在CSHL读博士后的时候主要研究哺乳动物细胞中核仁小分子RNA（small nuclear RNA，snRNA）基因的转录调控机制，特别是转录如何发生的具体细节。Mittal 在研究转录的时候，DNA 芯片技术方兴未艾，Mittal 于是想到，为什么要一次专注研究一个基因，而不是在全基因组范围内研究转录调控？
正好这个时候Michael Wigler在CSHL用DNA芯片研究癌症中基因的扩增。Mittal 对基因的表达非常感兴趣，跟着Wigler一年，很快CSHL给Mittal 自己的实验室开展DNA芯片的研究。Mittal 的实验室现在有几个独立的项目，其中之一是用RNAi技术和DNA 芯片技术研究Id介导的血管生成通路。他们的目标是鉴别出Id 基因相互作用网络中的成员，分析它们的活性机制，确认它们在肿瘤生成发展过程中的产生的影响。他们正在系统的采用RNAi介导基因表达抑制结合DNA芯片检测全局基因表达图谱的方法，将两个强大的技术结合起来，再加上功能分析，从而将Id基因调控通路的每个细节研究出来。
在肿瘤中描绘血管生成通路
这个Id转录因子基因家族包括Id1, Id2, Id3, 和Id4。它们是细胞周期调控、细胞分化等几个关键细胞进程的重要调控因子，也和血管生成和一系列癌症的失控有关。在成年人中Id1和Id3专一的在肿瘤血管内皮中表达，Id1或者是Id3缺失的小鼠模型中肿瘤不能生长或者转移。因此，Id和其下游目标底物有可能成为抗血管生成药物治疗的理想目标。
然而，说的容易做起来难。想确定哪个特定蛋白作为用药目标并不是那么容易的，所以研究人员需要先研究Id特异的信号通路来确定几个候选蛋白。好在Id1和Id3只在肿瘤血管中表达而不会在其他正常血管中表达。
通过和其他实验室的合作，Mittal的实验室采用 cDNA 芯片，生物信息学，RNAi技术和小鼠肿瘤模型来鉴别Id的目标靶，研究内皮细胞中的Id 通路。他们发现，肿瘤内皮细胞缺失Id1会导致a6和b4整合素，基质金属蛋白酶2 (matrix metalloproteinase-2 MMP-2)，成纤维细胞生长因子受体1的表达下调，同时在体内血管生成时抑制这些因子的表达会表现出Id基因缺失的拟表型。以往的实验结果也表明这些成员可能共同参与某些传导通路，比如bFGF在内皮细胞中上调整合素a6和b4，而MMP-2通过切割调控层粘连蛋白laminin-5（已知是a6b4 integrin的配体）来刺激表皮细胞的迁移。
因此，如果同样的通路确实在内皮细胞中发挥作用，那么Id 的缺失可能会由于下调这个通路中的3种重要的成员而缩短这个通路。这个研究展示了功能基因组学方法加上小鼠肿瘤模型如何作为一种新的手段应用于研发抗血管生成治疗药物。他们找到了新的基因，现在正在用RNAi技术对这个Id 基因网络作系统性研究。这种研究方法可以用在其他疾病模型的功能性分析上。
识别有效的RNAi探针
CSHL研究RNAi有一段历史了。有不少卓越的科学家和Mittal一起研究RNAi进展。Gregory Hannon教授曾经说过“激起对RNAi如此大的兴趣，正是由于RNAi确实有效”。研究人员采用RNAi技术已经超过2年，这项技术显然一直正常而有效的在研究系统中发挥作用。
著名的《Science》杂志评选2002年重大成就时表彰了Hannon, Shiv Grewal和 Rob Martienssen教授对RNAi机制和特性的深入研究，特别是RNAi和染色质结构的非遗传调控（epigenetic regulation）之间的关系。但是尽管有着如此多老练的科学家在进行研究，RNAi还是存在不少未知的空间。例如，尽管RNAi是如此强有力的一种研究哺乳动物细胞基因功能的工具，但是RNAi技术一直存在一个很大的难题：显然还缺少一种可靠的筛选RNAi靶位点的方法。就是说RNAi技术在哺乳动物细胞中的应用，一个难题是检测哪种RNAi探针能够最有效的抑制基因的表达。研究人员往往要根据一个基因不同区域制备5—6种RNAi探针，这样就严重限制了RNAi作为一种通用的基因功能分析工具在哺乳动物系统的广泛应用。
Mittal的实验室开发了一种能够针对任意基因快速鉴别有效的小分子干扰RNA(small interfering RNAs, siRNAs)或者是短发夹结构RNA(short hairpin RNA)探针的半定量方法。这种方法包括：通过检测RNA探针是否能够关闭一个特殊表达的嵌合了目的基因和报告基因的mRNA中的同源序列来有效鉴别RNA探针。通过一个荧光或者是酶类报告基因，siRNA 的效果可以被定量检测。Mittal的实验室检测了多个具有不同生理功能的基因，证实了siRNA 探针对嵌合了目的基因和报告基因的嵌合mRNA的抑制作用和对同源的内源目的基因的抑制作用是正相关的。
Mittal改造了一种基于微阵列的细胞转染方法，这种方法是以前由 Whitehead Institute for Biomedical Research, Cambridge, Mass.的科学家研究出来的，作为高通量平行实验中一种筛选有效的RNAi探针的平台。Mittal将这种基于微阵列的细胞转染成为RNAi芯片，并证实这种方法可以进行修改从而使之适应高通量筛选鉴别合适的RNAi探针——将探针点在DNA芯片上然后在玻璃片上面直接转染。
Mittal 认为：鉴别出能使某个基因沉默的有效siRNA，不仅对基础研究，同时也对基于RNAi的基因治疗和遗传工程修饰的动物模型都将产生重大影响。在这个领域过去的两年中，每隔半年就有一个令人吃惊的新发现，人们仍不清楚这种生理现象的功能和范围。当研究人员进一步掌握RNAi的作用机制时，我们就可以更好的了解RNAi的限制，同时也就能更好的设计更有效的抑制基因表达的东西。
干细胞的可塑性
深入了解干细胞在响应微环境变化时如何决定其最终分化方向的机制也是Mittal这个小组的另一个研究课题。他们试图了解在分化过程中那些基因的表达发生了变化。于是他们构建了特殊的转基因小鼠——小鼠的干细胞做了如下标记：有一个由干细胞启动子引导的绿色荧光蛋白，同时干细胞中还带有一个由分化细胞专一活性的启动子引导的红色荧光蛋白。通过不同的实验检验其荧光特征，随后进行芯片分析，这将帮助解开在细胞分化过程中那些基因表达发生和、变化是至关重要的。鉴别不同的分化通路将使得研究人员可以在体外控制干细胞的分化。干细胞移植被认为在减轻例如肌肉萎缩症，帕金森氏综合症和其他退行性病变的治疗中有重要的应用前景。
有关血管生成的一些背景细节：
Vivek Mittal, 针对血管生成中Id介导的信号通路的研究将有助于他们进一步开发开血管生成药物。什么是血管生成？这是指机体内一个重要的自然进程——新血管的生成。在健康的机体内这个进程通常发生在各种程度的伤口愈合，通常是由一系列的开关控制。“开”是指促进血管生成的生长因子，“关”则主要是血管生成的抑制因子。下面是一些最新的相关研究进展
Diseased or injured tissues produce and release angiogenic growth factors (proteins) that diffuse into the nearby tissues.
The angiogenic growth factors bind to specific receptors located on the endothelial cells of nearby preexisting blood vessels.
Once growth factors bind to their receptors, the endothelial cells become activated and signals are sent from the cell's surface to the nucleus. The endothelial cell's machinery then begins to produce new molecules including enzymes, which dissolve tiny holes in the sheath-like covering surrounding all of the existing blood vessels.
The endothelial cells divide and migrate out through the dissolved holes of the existing vessels toward the diseased tissue (tumor).
Specialized adhesion molecules, or integrins, help to pull the sprouting new blood vessels forward.
Enzymes such as matrix metalloproteinases are produced to dissolve the tissue in front of the sprouting vessel tip in order to accommodate it. As the vessel extends, the tissue is remolded around the vessel.
The sprouting endothelial cells roll up to form a blood vessel tube, which connect to form blood vessel loops that can then circulate blood.
Newly formed blood vessels are stabilized by specialized muscle cells that provide structural support and blood flow begins.
(Source: The Angiogenesis Foundation)
Name: Vivek Mittal
Title: Assistant professor, Cancer Research Genome Center, Cold Spring Harbor Laboratory
Web site: http://www.cshl.org
Education: PhD/Jawaharlal Nehru University, New Delhi, India, 1994; MS/Jawaharlal Nehru University, 1988; BS/St. Joseph's College, North Point, Darjeeling, India, 1985.
Current research: Technology development pertaining to DNA microarrays; use of DNA arrays in genome-wide analysis of cancer and tumor angiogenesis; design and implementation of informatics tools for analysis of array data.
制作RNAi芯片和应用于高通量筛选RNAi探针
左图：示意图显示生产和分析一块RNAi芯片的过程。两个质粒，一个编码目的基因-EGFP（加强型绿色荧光蛋白）融合基因，另一个编码RFP(红色荧光蛋白)作为内对照，连同各种RNAi探针一起被点在芯片上，然后和哺乳动物细胞一起培养，只有在最靠近DNA点附近的细胞会被转染，生长成明显不同的细胞群。用激光扫描仪进行检测每个细胞群的EGFP和RFP的荧光强度，并用分析软件对每个点的荧光强度进行定量。
右上图：激光扫描图象显示表达EGFP 和RFP的情况。右下图：RNAi芯片显示一个有效的EGFP特异的RNAi探针抑制EGFP而不是RFP的表达。一个非特异的探针不影响两个基因的表达。结果显示一个RNAi探针的特异性。这个方法可以用于有效的识别各种不同基因的最有效的RNAi探针。
