【交流】2.9kb 膜蛋白片段的EGFP-N3质粒克隆构建------快崩溃了

接手一个2.9kb的克隆构建，装入到EGFP-N3上，选择Xhol/BamhI,片断和质粒酶且完毕，可是怎么也连不上，无奈换酶切位点，换为SalI/BamhI，可是同样问题出现了，怎么也连不上!

无奈先换成克隆半段1.5kb，SalI/BamhI的位点，非常容易得得到克隆， 可是还要全长的啊，在中间靠上的位置找了个unique的酶切位点ppumI，然后把下半段的P出来，使用ppumI/BamhI切好，把构建好的上半段的克隆也使用ppumI/BamhI切好，可是同样问题出现了，怎么也连不上，

疯掉了，然后使用ECORI且了一个自连的t载体，肯定是切动了，因为酶切前后带性和位置有明显差别，载体去磷后，然后把平末端的全长片段与之相连，可是同样问题出现了，怎么也连不上，

我快崩溃了,前前后后近三个月了，这里我把序列贴出来，大家给各意见，到底怎么了？？ 2.9kb的克隆应该不这么难做，是不是下游BamHI位点有什么问题？序列如下

ctaggtcgac atgaatataagcaaaagtgagataacaactgaagcttctttaaaaccatctcggagatctctgccctgtctggctcagagctatgctcactcaaaaagcttgagtcaatctgcctcgctgtttcagtcaactgagagtgaatctcaggctccaacctctgtgacatttctttctgctgataaacctgaacatgttacttctgaggagagtagaaaagactctacccttaagtgttcctttgctgacctcagtgagttttgcttggctctggggaaagacaaggattacatggatgaatctgaacatgccaactatgatcgatctcgtctccttaatgactttgttaccaaagataaacctgaatccaagacaaagttatctaagaatgacatgaattacatagcatccagtgggcttttattcaaagatggcaaaaagagaattgattacatcctggtttatcgaaaaacaaatatacaatatgacaaaagaaacacatttgaaaagaacctgagagcagaaggcttgatgttggagaaggagccagcagttgccaatcctgacatcatgtttattaaagttcacattccatgggacacactgtgcaagtatgcagagaggctgaacatcagggtgcccttcaggaaaaaatgttactatactgaccagaagaacaagtcaatgagcagggtacaaaagtatttcaagagaatcaaaaaatggatgtcccaaaacccaatggttcttgacaagtcagcgtttccagagctggaggagtcggactgctacactggccctttcagcagagccaggattcaccactttataataaacaataaggacaccttcttcagcaacgctactcgcagcaggatagtctatcacatgttggaacgtaccaaatatgaaaacggaatatcaaaagtgggtattcgtaagcttatcaataatggctcatacatagcagcattccccccacacgagggagcctacaagagtagccttcccatcaaaacccatggacctcagaataacagacatctgttgtatgagcgctgggcacgctggggaatgtggtacaagcatcaacctctggacttaatcaggctgtactttggtgagaagattggcttatactttgcctggctgggatggtatactggaatgctgattcctgctgcagtggtcggcctatgtgttttcttctacggattagttacaatgaatgaaagtcaagtaagccaagaaatttgtaaagccaccgaagtcttcatgtgccctctgtgtgacaagaattgctcactgcagagactcaacgacagctgcatctatgccaaggtaacatatttgtttgataatggagggacagtcttcttcgctatttttatggcaatatgggccactgtctttcttgagttttggaaaaggagaagaagcatactgacttatacatgggaccttattgaatgggaagaagaggaggaaacacttcgtccccagtttgaagcaaaatactacaggatggagataataaaccctatcacagggaaacctgagcctcatcagccttcatctgacaaagtcacacgacttcttgtgtctgtctcagggatcttcttcatgatctccttggtcatcacagcagtgtttgcagttgtggtgtaccgtctggttgtcatggagcagtttgcatctttcaagtggaatttcatcaaacagcactggcagtttgctacatctggtgctgctgtctgtatcaacttcataatcatcatgctgctgaatcttgcctatgaaaaaattgcatacctcctcacaaatttagaatatcctcgaacagaatcagagtgggaaaacagctttgctttgaagatgttccttttccagtttgtcaatctgaacagttctatcttctatattgcattctttttgggaagattcgtaggccacccaggaaaatacaataaactttttgagcggtggagactggaggaatgccatcctagcggctgtctgatagacctctgcctccagatgggcgtcatcatgtttctgaagcaaatatggaacaacttcatggagctgggatatccgttaatccaaaactggtggtcacgacataaaatcaaacggggaatccaggatgcttccataccacaatgggaaaatgactggaaccttcagcctatgaacattcatgggctgatggacgaatacttagaaatggttttacagtttggttttactaccatctttgttgctgcttttcccctggcccctcttttggctttgttaaacaatatcatagaaatcagattggatgcatataaatttgtgacccagtggaggaggcctctgccagcccgagccactgacataggtatctggcttggaattcttgagggaattggcatattggctgtgatcaccaatgcatttgtaattgctattacatctgattacatcccacgttttgtctatgaatacaaatacggcccttgtgcaaatcatgtaaagcagaatgaaaattgcctgaagggatatgtcaacaatagcttatccttctttgacctgagtgaacttggtatcggaaaatccggttactgcaggtaccgagactatagaggccccccttggagttccaaaccctatgagttcaccttacagtactggcacatcctggctgctcgattggccttcattattgtgtttgagcatcttgtttttggcattaagtcattcattgcatacctgattccagatataccaaagggcctccgcgagcgcatacggcgagagaaatacttagttcaagaaatgatgtatgaggctgaactggaacatttacagcaacagagaagaaaaagtggtcagcctattcaccatgaatggccttagggatcc aga

难道是膜蛋白表达对于细菌造成致死性影响？？？
有几次是菌落PCR阳性，但是抽提质粒无结果，宿主菌是DH5a，应该不会表达吧？