【求助】MDCK转染与免疫荧光问题，解决问题追加丁当，谢谢！
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实验组：将带有c-myc和UT-B的pcDNA3.0质粒转染到MDCK细胞当中
对照组：1、将带有c-Myc和AQP1的pcDNA3.0质粒转染到MDCK细胞；
2、将GFP的质粒（就是一个只有GFP的质粒，没有UT-B,AQP1）转染MDCK细胞中，主要目的是想看我的操作技术怎么样；
3、过表达AQP1-MDCK的稳转细胞系。 然后通过免疫荧光来证实转染结果。（因为质粒若带有GFP会影响其功能，所以选择用标签染色的方法证实转染效果）
在每次免疫荧光之前我都会看一下GFP的荧光情况，有特异性的荧光表达。
然后我会对转染质粒的细胞进行染色。实验组的一抗我用的是c-myc,对照组1用的一抗为AQP1和c-myc,对照组3一抗用的是AQP1
试验结果：对照组3即阳性对照，能出现阳性结果，说明免疫荧光的操作没有问题。
对照组2，有GFP的荧光，说明至少转染GFP质粒没有问题。
但是，就是没法染出实验组c-myc和对照组1的AQP1和c-myc，一抗，二抗没有问题（别人用过，好用）
现在不知道问题出现哪里，还有什么可以在调整的。
希望大家帮帮忙，非常感谢！
对照组：1、将带有c-Myc和AQP1的pcDNA3.0质粒转染到MDCK细胞；
2、将GFP的质粒（就是一个只有GFP的质粒，没有UT-B,AQP1）转染MDCK细胞中，主要目的是想看我的操作技术怎么样；
3、过表达AQP1-MDCK的稳转细胞系。 然后通过免疫荧光来证实转染结果。（因为质粒若带有GFP会影响其功能，所以选择用标签染色的方法证实转染效果）
在每次免疫荧光之前我都会看一下GFP的荧光情况，有特异性的荧光表达。
然后我会对转染质粒的细胞进行染色。实验组的一抗我用的是c-myc,对照组1用的一抗为AQP1和c-myc,对照组3一抗用的是AQP1
试验结果：对照组3即阳性对照，能出现阳性结果，说明免疫荧光的操作没有问题。
对照组2，有GFP的荧光，说明至少转染GFP质粒没有问题。
但是，就是没法染出实验组c-myc和对照组1的AQP1和c-myc，一抗，二抗没有问题（别人用过，好用）
现在不知道问题出现哪里，还有什么可以在调整的。
希望大家帮帮忙，非常感谢！
"就是没法染出实验组c-myc和对照组1的AQP1和c-myc，"
实验组的UT-B可以染出来吗?
1. 全面复核表达载体的结构, 序列. 确定表达载体中c-myc, AQP1, UT-B的基因序列没有问题, 特别是移框突变.
2. pcDNA3.0是双promoter表达系统吧? 谁做的克隆? 有没有可能克隆过程中酶切损伤了载体功能结构?
3. 双promoter表达系统按理是不可能两个蛋白表达都出现问题的. 可能的解释就是上面第二点了.
4. 推测克隆时是先插入c-myc, 然后在pcDNA3.0/c-myc载体上进一步插入AQP1或UT-B, 得到pcDNA3.0/c-myc+UT-B和pcDNA3.0/c-myc+AQP1. 所以可能是c-myc克隆时损伤了pcDNA3.0结构. 如果有pcDNA3.0全序列的话, 做2个表达载体的全长测序比对吧.
实验组的UT-B可以染出来吗?
1. 全面复核表达载体的结构, 序列. 确定表达载体中c-myc, AQP1, UT-B的基因序列没有问题, 特别是移框突变.
2. pcDNA3.0是双promoter表达系统吧? 谁做的克隆? 有没有可能克隆过程中酶切损伤了载体功能结构?
3. 双promoter表达系统按理是不可能两个蛋白表达都出现问题的. 可能的解释就是上面第二点了.
4. 推测克隆时是先插入c-myc, 然后在pcDNA3.0/c-myc载体上进一步插入AQP1或UT-B, 得到pcDNA3.0/c-myc+UT-B和pcDNA3.0/c-myc+AQP1. 所以可能是c-myc克隆时损伤了pcDNA3.0结构. 如果有pcDNA3.0全序列的话, 做2个表达载体的全长测序比对吧.
真的非常感谢您！
我的实验组也没有染出UT-B。实际上，我的的实验组用UT-B和c-myc的一抗分别进行了染色，但是都没有染出来。
这2个质粒都是老板在美国做的，已经有2-3年的时间了，期间由于多次实验取用，也反复冻融过，会不会对质粒的结构造成影响？
我初学，在这方面没有什么经验。谢谢您的指导！
我的实验组也没有染出UT-B。实际上，我的的实验组用UT-B和c-myc的一抗分别进行了染色，但是都没有染出来。
这2个质粒都是老板在美国做的，已经有2-3年的时间了，期间由于多次实验取用，也反复冻融过，会不会对质粒的结构造成影响？
我初学，在这方面没有什么经验。谢谢您的指导！
wen-wen wrote:
真的非常感谢您！
我的实验组也没有染出UT-B。实际上，我的的实验组用UT-B和c-myc的一抗分别进行了染色，但是都没有染出来。
这2个质粒都是老板在美国做的，已经有2-3年的时间了，期间由于多次实验取用，也反复冻融过，会不会对质粒的结构造成影响？
我初学，在这方面没有什么经验。谢谢您的指导！
你的实验和对照组用的是哪几个质粒?
从前文我推测你用的是: 1. 处理组"c-myc/UT-B的pcDNA3.0质粒tranfected cells". 2. 对照一组"c-Myc-pcDNA3.0质粒和AQP1-pcDNA3.0质粒co-tranfected cells". 3. 对照二组"GFP-pcDNA3.0质粒tranfected cells". 4. 对照三组"AQP1-MDCK cell line".
对照组3即阳性对照，能出现阳性结果.
对照组2，有GFP的荧光
但是，就是没法染出实验组c-myc和对照组1的AQP1和c-myc
这样说来你老板从美国带来的3个质粒("c-myc/UT-B的pcDNA3.0质粒", "c-Myc-pcDNA3.0质粒", "AQP1-pcDNA3.0质粒")都有问题, 而"GFP-pcDNA3.0质粒"和"AQP1-MDCK cell line"都没问题, 是不是?
如果我上面说的没有错, 很简单你老板从美国带来的3个质粒大量降解了. 你做实验之前没有从新转化挑克隆扩增质粒.
"GFP-pcDNA3.0质粒"和"AQP1-MDCK cell line"都没问题是因为它们都是一直在常规maintain的.
解决办法是把你老板从美国带来的3个质粒从新转化挑克隆扩增质粒.
应该有叮噹吧?
还有追加?!
对照一组"c-Myc-pcDNA3.0质粒和AQP1-pcDNA3.0质粒co-tranfected cells".
这个对照组的质粒是pcDNA3.0-AQP1，这个质粒带有c-myc标签
处理组的质粒是pcDNA3.0-UT-B，这个质粒也带有c-myc标签
我测了质粒的浓度，没有降解。
对于个的困境我也很晕，不知道还有什么可以再弄的。
这个对照组的质粒是pcDNA3.0-AQP1，这个质粒带有c-myc标签
处理组的质粒是pcDNA3.0-UT-B，这个质粒也带有c-myc标签
我测了质粒的浓度，没有降解。
对于个的困境我也很晕，不知道还有什么可以再弄的。
wen-wen wrote:
对照一组"c-Myc-pcDNA3.0质粒和AQP1-pcDNA3.0质粒co-tranfected cells".
这个对照组的质粒是pcDNA3.0-AQP1，这个质粒带有c-myc标签
处理组的质粒是pcDNA3.0-UT-B，这个质粒也带有c-myc标签
我测了质粒的浓度，没有降解。
对于个的困境我也很晕，不知道还有什么可以再弄的。
"我测了质粒的浓度，没有降解". ----这是从何说起? DAN吸光度并不能反映DNA降不降解吧, 去看看原理先.
电泳倒是可以反映DNA降解问题.
我说的没错啦.
将质粒1:5稀释之后我跑了胶（右边的图），可以看到有很长的头尾，第二次我1:10稀释又跑了一次胶（左边的图：这次我还跑了没有稀释的质粒），还是拖尾，是不是降解了啊？
我给老板看了，他说降解的拖尾是想电泳方向的，跟我这个相反，他也觉得很奇怪，他让我从新纯化。
我给老板看了，他说降解的拖尾是想电泳方向的，跟我这个相反，他也觉得很奇怪，他让我从新纯化。
wen-wen wrote:
将质粒1:5稀释之后我跑了胶（右边的图），可以看到有很长的头尾，第二次我1:10稀释又跑了一次胶（左边的图：这次我还跑了没有稀释的质粒），还是拖尾，是不是降解了啊？
我给老板看了，他说降解的拖尾是想电泳方向的，跟我这个相反，他也觉得很奇怪，他让我从新纯化。
左看看，右看看，图呢？ ---极大可能还是降解了，重新纯化的好。
wen-wen wrote:
将质粒1:5稀释之后我跑了胶（右边的图），可以看到有很长的头尾，第二次我1:10稀释又跑了一次胶（左边的图：这次我还跑了没有稀释的质粒），还是拖尾，是不是降解了啊？
我给老板看了，他说降解的拖尾是想电泳方向的，跟我这个相反，他也觉得很奇怪，他让我从新纯化。
左看看，右看看，图呢？ ----很大可能还是降解了，重新纯化的好。
我这几天家里有事，没有及时看到您的回复。很不好意思。
电泳图在实验室，我明天会记得传上来的。我真是马虎啊！
我纯化过了，并且把纯化的质粒进行了酶切线性化。线性化的质粒没有明显的拖尾，但是环形的质粒还是有拖尾，跟前两次一样。我们实验室跑电泳的缓冲液是TBE，他们说应该用TAE，而且电泳液很久没换过，可能会有影响吧。我明天重新配TAE再跑跑看吧。
其实我现在最担心的是，这样会发生拖尾的质粒会不会影响转染啊？谢谢！
电泳图在实验室，我明天会记得传上来的。我真是马虎啊！
我纯化过了，并且把纯化的质粒进行了酶切线性化。线性化的质粒没有明显的拖尾，但是环形的质粒还是有拖尾，跟前两次一样。我们实验室跑电泳的缓冲液是TBE，他们说应该用TAE，而且电泳液很久没换过，可能会有影响吧。我明天重新配TAE再跑跑看吧。
其实我现在最担心的是，这样会发生拖尾的质粒会不会影响转染啊？谢谢！
换成成TAE buffer后就没有拖尾了，还挺清楚的了。谢谢您的帮助！怎么追加丁当啊？
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