【求助】RT-PCR判断RNA方向

kw412573902 wrote:
大家好，有个十万火急的问题想得到大家的帮助：

我们经过深度测序找到了一批rna，由于得到的序列结果是测序时的RNA经过公司逆转录并扩增成为PCR产物的序列，所以现在需要设计两个不同方向的逆转录引物，进行RT-PCR，确定RNA到底是正义链上的还是反义链上的序列，之前做的都挺好的，但是后来发现所有的序列都是两个方向都有的。。。而且之前的实验结果也重复不出来了。。。。我已经把所有RT-PCR过程中用到的试剂都换了一遍，还是不行。。。。不知道是什么原因，请大家帮帮我，谢谢大家！

顺便说下，我还做了两个control，一个是在RT时，不加逆转录酶，其他东西都加；另一个control 是在PCR阶段，不加cDNA模板，但是跑了胶之后发现这两个control都没有带，看起来都没问题。但RNA还是两个方向。。。

zitong1983 wrote:
跟着楼主的问题搭个顺风车吧。如果我想研究某一mRNA的降解情况，特别是想了解它是从5‘端还是从3’端开始讲解，有没有一种可能，就是通过在mRNA的不同位置设计不同的引物，然后进行rt-pcr分析，最终判断是哪一端最先开始降解？

zjubell wrote:
mRNA一般就是5端开始降解。
你想通过设计引物法，其实不是很靠谱，因为一个mRNA，同时会有很多拷贝，并非降解程度都完全一样的。
这个可以参考一下affymetrix的芯片原理，可以通过对整条mRNA，不同部分设计探针，通过杂交，然后比较不同位置探针发出的荧光信号强弱，可以判断哪些区域完整性更好。

zitong1983 wrote:
非常感谢回复。再多问一句，根据你提到的affymetrix的芯片原理，那么通过northern blot是不是同样可以判断哪些区域完整性更好而其它区域已经降解？

zjubell wrote:
哈哈，affymetrix的芯片杂交原理，就是northern啦，他就是DNA与RNA杂交的。