【求助】请问质粒转化感受态细胞的原理是什么
丁香园论坛
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有个问题请教一下前辈们,当质粒与感受态菌混在一起做转化时,同一个菌是否有可能吸收进不同的质粒载体,比如同时吸收了含有不同目的基因的载体进入细胞?若有可能,那为什么挑去单克隆去测序,往往是单一目的片段的。若不可能,请告诉我为什么。谢谢
cnstr14 wrote:
有个问题请教一下前辈们,当质粒与感受态菌混在一起做转化时,同一个菌是否有可能吸收进不同的质粒载体,比如同时吸收了含有不同目的基因的载体进入细胞?若有可能,那为什么挑去单克隆去测序,往往是单一目的片段的。若不可能,请告诉我为什么。谢谢
理论上当然可能吸收进不同质粒。特别是有一些多拷贝菌,能吞进几十个。
但你实验的目的是什么?你总是想拿到单克隆吧,那么
1:你一般选择的DH5alpha, 等,不会吸收太多拷贝数了
2:也是最重要的,你干嘛将不同目的基因片段与质粒做连接啊?不是自找麻烦么,你买来的空质粒肯定是纯的,然后你自己PCR或者酶切得到的产物,也必须纯化过,是单一的片段才能去连接,然后再转质粒,再蓝白斑筛选。筛选出来的细菌,只可能含有一个或若干个相同质粒。再挑单克隆去测序,当然单一序列了。如果你吸收了不同目的基因的载体进入细菌,那你刚开始的PCR产物就不纯,导致质粒不纯,实验是彻底失败的,即使侥幸成功,也是不严谨科学的。
zjubell wrote:
理论上当然可能吸收进不同质粒。特别是有一些多拷贝菌,能吞进几十个。
但你实验的目的是什么?你总是想拿到单克隆吧,那么
1:你一般选择的DH5alpha, 等,不会吸收太多拷贝数了
2:也是最重要的,你干嘛将不同目的基因片段与质粒做连接啊?不是自找麻烦么,你买来的空质粒肯定是纯的,然后你自己PCR或者酶切得到的产物,也必须纯化过,是单一的片段才能去连接,然后再转质粒,再蓝白斑筛选。筛选出来的细菌,只可能含有一个或若干个相同质粒。再挑单克隆去测序,当然单一序列了。如果你吸收了不同目的基因的载体进入细菌,那你刚开始的PCR产物就不纯,导致质粒不纯,实验是彻底失败的,即使侥幸成功,也是不严谨科学的。
但是,若是将不同目的片段与质粒做连接的作文库的话,就不是自找麻烦了。还有我遇到这样的情况,我挑取了单克隆,经过载体通用引物PCR鉴定是含有目的片段大小的重组克隆,但是测序结果显示是质粒本身的序列,并且大小远远小于目的片段,这是怎么回事?
哦,那你就选择单拷贝的载体。不要选择那种能转进多个质粒的载体。
不过现在还有多少人会用这种方法建文库啊?不如直接测序来的快啊
至于你说用通用引物鉴定发现是持本身序列,是否引物的特异性问题啊。
你应该先用通用引物先PCR,跑个胶看一下条带,然后再去测序。或者你的通用引物错了?
不过现在还有多少人会用这种方法建文库啊?不如直接测序来的快啊
至于你说用通用引物鉴定发现是持本身序列,是否引物的特异性问题啊。
你应该先用通用引物先PCR,跑个胶看一下条带,然后再去测序。或者你的通用引物错了?
质粒的不相容性
zjubell wrote:
哦,那你就选择单拷贝的载体。不要选择那种能转进多个质粒的载体。
不过现在还有多少人会用这种方法建文库啊?不如直接测序来的快啊
至于你说用通用引物鉴定发现是持本身序列,是否引物的特异性问题啊。
你应该先用通用引物先PCR,跑个胶看一下条带,然后再去测序。或者你的通用引物错了?
是先用通用引物先PCR的,跑胶条带大小也对,通用引物设计是基于质璃载体公布的序列,并且位置就是分布在克隆位点两边的。
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