【求助】NF-KB p65测定疑问

请教各位高手！我最近打算做药物对肾脏疾病NF-KB信号通路的干预作用，想用Western Blot测定NF-KB p65活性。但是我在查文献及抗体的时候发现以下几个问题：
1、NF-KB p65存在不存在磷酸化？如果不存在磷酸化为什么抗体公司用磷酸化抗体？
2、一些国外的文献NF-KB p65活性测定采用的是普通的抗体，也有文献采用的是磷酸化的抗体，所以很不理解。园子的朋友说p65活化后入核，所以测核内普通的NF-KB p65活性与测总的NF-KB p65活性意义是一样的，我想知道是不是这样？
3、对于NF-KB p65活性测定，用p-p65抗体测定时，组织蛋白提取能不能用全蛋白提取试剂盒？还是必须用包浆蛋白或者核蛋白提取试剂盒？检索版内资源，楼主曾建议提核蛋白，然后用磷酸化的p65测定。我想问，只有活化的p65才会入核，那么为什么一定要用核蛋白呢？
4、对于NF-KB p65活性测定时，内参应该选用actin还是GAPDH？如果用GAPDH做内参影响大吗？
期盼您的答复，谢谢！！

看来你对此分子了解的还是不多，一旦你选择要做一个课题，对此了解这么点你觉得能够做好吗，至少也得混毕业吧！
NF-KB p65存在磷酸化，但是Western Blot测定NF-KB p65的磷酸化是比较难做的，由于p65活化后入核，所以抽提核蛋白，测定核内的NF-KB p65的表达与测NF-KB p65的磷酸化一致的，至少反应的是相同的效果，所以你说的2种方法都是可以的。只是看你的选择了，提取核蛋白的试剂盒也不便宜，但是做磷酸化比较难做。就看你的取舍了。
关于内参，如果是做NF-KB p65的磷酸化可以使用actin也可以使用GAPDH，但是你需要做核蛋白的话，一般使用组蛋白作为内参。
建议自己多查一点资料，学会搜索，学会取舍！

多谢楼主指点！！我是初次接触这个分子，对许多东西不是很了解，接下来一定会学习相关文献！！再次谢谢！！

多谢楼主指点！！我是初次接触这个分子，对许多东西不是很了解，接下来一定会学习相关文献！！再次谢谢！！