【求助】【求助】将病毒载体感染细胞只有部分基因表达为什么，什么方法可以探究基因未表达的原因

最近做慢病毒感染细胞，慢病毒载体是自己包装的，含有筛选基因，marker基因，还有目的基因。第一次做筛选基因是G418，但是可见部分细胞表达marker基因，但是加药筛选不死，最后检测目的基因有表达。很奇怪。后来重做将筛选基因换成Hygromycin，感染48h小时加药，细胞死亡明显，最后形成单克隆，但是没有看到marker基因的表达，测目的基因有表达，两次结果都有些戏剧性。

总结起来我的问题就是明明导入了三个基因，总有一个基因没有表达？请大家出出主意是什么问题？哪些实验方法可以帮助发现问题。

我想了几下原因：
1。各个基因表达的不均衡性，可能是marker基因表达太弱。不能被检测
2.可能是不同基因的启动子不一样，我的是CMV和EF1，细胞对启动子不敏感
3.外源基因的启动子被沉默失效
4.存在基因剪切错误的问题，但是我的基因链接是用T2A，可以剪切的。

只能想到这些问题。
老板让分析一下。但我对这方面了解不是很多。我准备用PCR看看基因是否导入，western-blot看看目的基因在蛋白质水平的表达，其余的方法我就不知道了。测序那就别提了啊

期待各位来一次头脑风暴！感激！帮忙顶一下啊。

EF1a is a weak promoter, in some cell lines its expression may not strong enough.

about T2A, you have to confirm the reading frame is correct.

谢谢指点！

请问 楼主 T2A是什么序列 有没有相关文献 谢谢。
我只看到过 Self‐cleaving 2A peptide
谢谢

个人举得需要考虑的问题有：
1、慢病毒本身表达的能力，各种病毒中的基因组元件是否相同。诸如启动子元件，是否有后启动子等都影响病毒中基因元件的表达。目前的基因治疗中CAG 启动子已经被证明明显比CMV好，EF1是很早之前用的启动子了。所以你可以看看以前用这个质粒包装的慢病毒的表达情况，然后和你的比较一下，看看是本身元件的问题还是你自己试验的问题。
2、病毒滴度：做病毒表达，必须考虑的问题一定是滴度有多大。滴度小了，表达自然会很小。3、不明白你做的是融合蛋白还是含有三种不同基因的三种慢病毒。如果是融合蛋白，那说明可能是做融合蛋白的元件搭配上出现问题。哪个在前或者哪个在后都会有影响。如果是三种不同的病毒，那可以先做一下单感染，看看表达。

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