【求助】HIV-gp41原核表达

为什么HIV-gp41与原核PET28a质粒构建后，行诱导表达，SDS-PAGE无结果，而WB却有结果，这种情况怎么回事？（构建后测序同源性达95%，而且已酶切认证构建成功） 谢谢

“SDS-PAGE无结果，而WB却有结果”是什么意思，你表述清楚一点，要不人家会有疑惑的。其实这主要看你是否诱导成功。个人认为还有就是你在原核里面表达，作为包涵体存在形式，你是否将蛋白提出来了呢？

首先，我有点疑问，为什么你构建后测序同源性达95%？这个同源性怎么理解呢？一般测序应该是100%的和原序列相同的吧？至少在预测的蛋白质序列上要100%和原序列相同。要不然很难说明问题。再说了，你有没有排除掉你现在这个序列中是否含有终止密码子呢？

SDS-PAGE无结果，而WB却有结果。不知道你的样品是怎么处理的？如果是直接那细菌用sample buffer来裂解的话，那么可能一个可能是蛋白的表达量太少，考马斯亮蓝染色检测不到。这种情况下可能要检查一下你的序列会不会出现什么问题。或者试一下改变表达的条件：温度，IPTG,菌株等等，来提高蛋白表达量。另外一个可能就是蛋白形成包涵体。如果是用裂解液裂解离心后取上清去跑胶的话，那么也有可能是形成了包涵体，可以考虑改变表达的条件看能不能使之变成可溶解的，要不然就试着从包涵体中提取蛋白吧。

我的建议是：

1： 重新再检查一下你的序列。确保万无一失，要不然到最后才发现是序列有问题的话，那才是够郁闷的。

2： 表达的时候，建议细菌进行裂解后，离心分别收集上清和沉淀分别跑胶，进行考染和WB，看看到底是什么情况。最好能加上一个阳性对照，这样才能说明问题呀。

通常表达量低的时候，PAGE是看不到的，但WB则可能阳性。