【求助】QPCR标准曲线标准品及内参基因NADPH
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求助：
我想做一个QPCR检测肝癌组织及正常组织的一个基因表达，我是用哪个做标准品建立标准曲线；另外关于人的内参NAPDH的引物序列，不同文献不同，我应该怎样选择。谢谢
我想做一个QPCR检测肝癌组织及正常组织的一个基因表达，我是用哪个做标准品建立标准曲线；另外关于人的内参NAPDH的引物序列，不同文献不同，我应该怎样选择。谢谢
你要做绝对定量还是相对定量？
既然你提取用内参，那应该就是相对定量了
所以不需要标准品做标准曲线。但你需要对你的两对引物进行扩增效率测试
也是10倍稀释，就拿cDNA即可。
如果两个梯度间的Ct值差异刚好是3.326,就非常好了，达到100%的扩增效率。
GAPDH看家基因，每个实验室应该都有现成的。随便哪个都行，但请注意，扩增产物长度
最好跟你的目的基因类似，退火温度也一致。
既然你提取用内参，那应该就是相对定量了
所以不需要标准品做标准曲线。但你需要对你的两对引物进行扩增效率测试
也是10倍稀释，就拿cDNA即可。
如果两个梯度间的Ct值差异刚好是3.326,就非常好了，达到100%的扩增效率。
GAPDH看家基因，每个实验室应该都有现成的。随便哪个都行，但请注意，扩增产物长度
最好跟你的目的基因类似，退火温度也一致。
两对引物进行扩增效率测试是做什么用呢?
这是相对定量计算公式的假设之一。
两对引物的扩增效率是相同的。
两对引物的扩增效率是相同的。
就是绝对定量里那个Ct=-y（e）logXo+x（e）么？看了网上的一些资料，我一直没明白相对定量是怎么回事，内参和目的基因的扩增系数本就不可能相同啊。。。
内参和目的基因的扩增系数尽量一样，才可以用delta delta法直接进行计算，如图
但并非lz上所说的，扩增系数不可能相同。
一个循环2倍扩增，还是很容易实现的。怎么会不可能相同呢？
但并非lz上所说的，扩增系数不可能相同。
一个循环2倍扩增，还是很容易实现的。怎么会不可能相同呢？
然而有些情况，两个基因的扩增效果不同。如果差异比较小，可以考虑用公式进行修正。如下图：
如果差异非常大，我个人是不建议用公式修正的，因为一定是引物设计的不好，或者条件不对，扩增效率在90%以下的，或者在110%以上，都建议重新设计引物。因为扩增效率肯定不正确，用修正公式会误导。
如果差异非常大，我个人是不建议用公式修正的，因为一定是引物设计的不好，或者条件不对，扩增效率在90%以下的，或者在110%以上，都建议重新设计引物。因为扩增效率肯定不正确，用修正公式会误导。
哇~~~昨天刚收藏了你的一篇关于可变剪切的文章,非常感谢,学习了.
昨天又看了一篇关于两对primer的预实验看e是否相同,个人理解是不是我的待测样品并不需要知道浓度的情况下,与参照基因一起稀释以各种倍数进行稀释,让后进行q-RT-PCR,如果不论什么稀释倍数,它们俩总是deltaCt相同就说明问题?
前辈的第二章图是用Ct对稀释倍数做图的吧?
昨天又看了一篇关于两对primer的预实验看e是否相同,个人理解是不是我的待测样品并不需要知道浓度的情况下,与参照基因一起稀释以各种倍数进行稀释,让后进行q-RT-PCR,如果不论什么稀释倍数,它们俩总是deltaCt相同就说明问题?
前辈的第二章图是用Ct对稀释倍数做图的吧?
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