【求助】基因芯片验证问题
丁香园论坛
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基因芯片数据分析时，比值大于2.0或者小于0.5被认为是有表达差异，为什么要相差两倍呢？这个比值与PCR或Western blot验证时的基因或蛋白表达差异是否是一致的(即是否也是相差两倍以上)？按理说PCR或Western blot检测表达差异根本不需要相差两倍以上，这还取决于重复实验的次数及数据的分布情况。
liuwenbinahslyy wrote:
基因芯片数据分析时，比值大于2.0或者小于0.5被认为是有表达差异，为什么要相差两倍呢？这个比值与PCR或Western blot验证时的基因或蛋白表达差异是否是一致的(即是否也是相差两倍以上)？按理说PCR或Western blot检测表达差异根本不需要相差两倍以上，这还取决于重复实验的次数及数据的分布情况。
2倍差异表达只是一种较为常用或通用的做法，具体到个人的实验，肯定不是这样的。
如果是2倍差异，那qPCR结果很可能是4倍以上。
拿到基因芯片数据后，先大致看一下2倍差异，如果很多，则将倍数调整为5倍，10倍，直到自己觉的有能力分析为止，先将范围缩小。研究完了，再将范围扩大，4倍，2.5倍，继续研究，分析完后，如果还有能力，再研究2倍，等等。
如果拿到数据，发现2倍差异的就几个，那就扩大范围，比如1.5倍差异的也全包括进来。
如果是一些调节基因，或者是自己想研究的目的基因，那不管几倍，都得圈进来分析。
芯片实验，最忌讳的是自己一点想法也没有，也没有预期实验结果，纯粹抓把泥放入细胞，然后测实验和对照组，再让人家把2倍差异，GO，信号通路全部弄出来，还要讲出生物意义的。
非常感谢zjubell战友的解答!可我还是不明白为何“如果是2倍差异，那qPCR结果很可能是4倍以上。”的道理，盼望战友再指点指点。谢谢大家!
基因芯片挑选差异基因的原则：
1、根据统计学原理挑选P值小于0.01的基因（如果没有就选P值小于0.05的基因）。不建议直接按照2倍差异来挑，除非你没有做样本重复，但是发文章时绝对会麻烦。
2、如果是挑表达上调的差异基因的那组样本，那么必须信号值为检出（表明为P的基因）；如果是挑表达下调的差异基因的那组样本则原则可以不考虑信号值，但在定量PCR验证时会不能检出。——所以最好还是都选信号值检出的基因。
3、最后考虑表达差异倍数2倍以上。
——因为芯片数据和定量PCR不完全一致，目前以定量为金标准，同时满足这3个条件的基因定量验证的一致性会高。
总结：任何实验都绝对要多个样本，统计学方法挑选差异基因（看P值）！
1、根据统计学原理挑选P值小于0.01的基因（如果没有就选P值小于0.05的基因）。不建议直接按照2倍差异来挑，除非你没有做样本重复，但是发文章时绝对会麻烦。
2、如果是挑表达上调的差异基因的那组样本，那么必须信号值为检出（表明为P的基因）；如果是挑表达下调的差异基因的那组样本则原则可以不考虑信号值，但在定量PCR验证时会不能检出。——所以最好还是都选信号值检出的基因。
3、最后考虑表达差异倍数2倍以上。
——因为芯片数据和定量PCR不完全一致，目前以定量为金标准，同时满足这3个条件的基因定量验证的一致性会高。
总结：任何实验都绝对要多个样本，统计学方法挑选差异基因（看P值）！
版主zhujoker留言:
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基因芯片本身是高通量的检测方法，由于一次性检测基因数目较多，不可避免的出现假阴性和假阳性，这就是为什么芯片一般需要重复试验，甚至同一张芯片上都要有不同对照的目的，我个人认为客观的说应该把基因芯片定位在高通量、初筛的定性检测手段，芯片的结果只是给你下游试验提供一些线索，mRNA水平的表达必须通过定量PCR来验证，不能直接利用芯片的结果来区分基因表达量的差异。
侠骨仁医 wrote:
基因芯片本身是高通量的检测方法，由于一次性检测基因数目较多，不可避免的出现假阴性和假阳性，这就是为什么芯片一般需要重复试验，甚至同一张芯片上都要有不同对照的目的，我个人认为客观的说应该把基因芯片定位在高通量、初筛的定性检测手段，芯片的结果只是给你下游试验提供一些线索，mRNA水平的表达必须通过定量PCR来验证，不能直接利用芯片的结果来区分基因表达量的差异。
感谢各位老师的解答! 我最近一次做的是SABiosciences公司的Real-time PCR芯片，这个芯片他们公司说不用用定量PCR来验证。请问此芯片所测的比值(两个芯片)就能反映真实的mRNA表达水平差异了是吧？
“请问此芯片所测的比值(两个芯片)”---不好意思! 不是“两个芯片”，是筛选两株细胞差异基因。
liuwenbinahslyy wrote:
感谢各位老师的解答! 我最近一次做的是SABiosciences公司的Real-time PCR芯片，这个芯片他们公司说不用用定量PCR来验证。请问此芯片所测的比值(两个芯片)就能反映真实的mRNA表达水平差异了是吧？
qPCR成本很低的
对于你这个芯片，似乎是非主流的类型，我不做评论。
但结果是否可信，我建议你先挑选4－8个，用qPCR先验证一下，如果都跟芯片结果match，
那你就相信他的结果好了。
如果有一半都mismatch,那你自己看着办。
有些事可以自己先思考一下，别人的意见不一定都正确。
谢谢zjubell老师的指教!
其实，任何技术都很难在高通量与准确度上两全的，芯片只是用来初筛，将范围缩小在一个空间内，至于筛选的标准各个平台有不同的方式。
严格讲应该做多样本的组内重复，根据两组的统计检验(如T-test)来选择有显著差异的基因，即P值很小。但实际上很多人无法做到太多的样本重复，所以就简单地用两倍法来挑选，这只是约定俗成的做法，缺乏理论根据。
但是如果只是用来初筛的话2倍法也无大碍，因为筛完后一般都会将芯片的数据再进行QPCR验证的，至少应将你确认感兴趣的几个做一下验证，一是对芯片数据的检验，二是可以扩大样本检验。对于楼主说的SABiosciences的芯片我不了解，但是我同意zjubell的处理方式，毕竟验证之后才放心。
严格讲应该做多样本的组内重复，根据两组的统计检验(如T-test)来选择有显著差异的基因，即P值很小。但实际上很多人无法做到太多的样本重复，所以就简单地用两倍法来挑选，这只是约定俗成的做法，缺乏理论根据。
但是如果只是用来初筛的话2倍法也无大碍，因为筛完后一般都会将芯片的数据再进行QPCR验证的，至少应将你确认感兴趣的几个做一下验证，一是对芯片数据的检验，二是可以扩大样本检验。对于楼主说的SABiosciences的芯片我不了解，但是我同意zjubell的处理方式，毕竟验证之后才放心。
谢谢指教!
还用芯片啊。
芯片数据分析时选择2倍或0.5倍作为一个标准，其实是一个比较省事或者说比较傻的一个处理方式，为什么要选择2作为一个杠杆呢？参与生命过程中的重要基因往往微小变化就能引起生命过程的颠覆，因此要根据自己的试验目的，别漏掉了哪些重要的东西！
谢谢各位老师的意见!
liuwenbinahslyy wrote:
感谢各位老师的解答! 我最近一次做的是SABiosciences公司的Real-time PCR芯片，这个芯片他们公司说不用用定量PCR来验证。请问此芯片所测的比值(两个芯片)就能反映真实的mRNA表达水平差异了是吧？
real time PCR array是比较新的技术，结合了芯片的高通量和Q-PCR的精确性，无需再进一步验证，一般判断标准为同时满足P<0.05和Fold change>2。当然如果检测出差异表达基因较多，可以将Fold change的标准定为4。
自身抗体 wrote:
real time PCR array是比较新的技术，结合了芯片的高通量和Q-PCR的精确性，无需再进一步验证，一般判断标准为同时满足P<0.05和Fold change>2。当然如果检测出差异表达基因较多，可以将Fold change的标准定为4。
谢谢! 那我可以在蛋白水平验证一下应该就行了。
请问 如果我没有重复样本，如何选择我要找的目的差异基因？
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