【求助】实验设计中RNA干扰封闭某基因表达后能否在转入表达该基因的载体
丁香园论坛
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如题。
准备做有关肿瘤细胞信号转导机制的研究。疾病模型中A对B的作用。对象：人的肿瘤细胞系。
思路：某处理因素作用下,A升高，检测B的升高。
A knockdown， B无改变。
A knockdown cell 转入携带有外源基因的表达载体，检测B升高。
问题1： 因为没有查到与该研究相关的直接相关文献，无法参考，但是我认为信号转导途径的研究大致应该如此。然而，关于Knockdown的方法，如选择RNA干扰，操作方便。但是，在后面的步骤中，能否在已经进行RNA干扰的肿瘤细胞中，再次加入外源a基因的表达载体。如选择做knockdown cell，我觉得技术上不可行吧，因为我做的是人的肿瘤细胞，而非鼠的细胞系。关于此问题，我潜意识觉得没有这么简单，一个细胞中能否先RNA干扰在加入基因表达载体呢？请问园子里的达人们，我是个新手加菜鸟，希望能得到帮助。
问题2，在后续的实验设计中，是否加入外源基因的表达载体使之overexpress？我本人认为没有必要加后一步，因为第一步已经验证了在某处理因素下A较正常组升高，B也升高。请大家帮助！
谢谢哦！祝大家新年好！
准备做有关肿瘤细胞信号转导机制的研究。疾病模型中A对B的作用。对象：人的肿瘤细胞系。
思路：某处理因素作用下,A升高，检测B的升高。
A knockdown， B无改变。
A knockdown cell 转入携带有外源基因的表达载体，检测B升高。
问题1： 因为没有查到与该研究相关的直接相关文献，无法参考，但是我认为信号转导途径的研究大致应该如此。然而，关于Knockdown的方法，如选择RNA干扰，操作方便。但是，在后面的步骤中，能否在已经进行RNA干扰的肿瘤细胞中，再次加入外源a基因的表达载体。如选择做knockdown cell，我觉得技术上不可行吧，因为我做的是人的肿瘤细胞，而非鼠的细胞系。关于此问题，我潜意识觉得没有这么简单，一个细胞中能否先RNA干扰在加入基因表达载体呢？请问园子里的达人们，我是个新手加菜鸟，希望能得到帮助。
问题2，在后续的实验设计中，是否加入外源基因的表达载体使之overexpress？我本人认为没有必要加后一步，因为第一步已经验证了在某处理因素下A较正常组升高，B也升高。请大家帮助！
谢谢哦！祝大家新年好！
顶起来啊！
1、对于体外培养的细胞，这样做完全可以，技术上不成问题，但要设计合适的阴性对照。
2、有必要做overexpress，也就是A进一步升高导致B的进一步升高，以验证之前的结论，并且这种RNAi和overexpress配合“某处理因素作用”的实验结果可以为肿瘤治疗提供新的靶标，何乐而不为呢？
2、有必要做overexpress，也就是A进一步升高导致B的进一步升高，以验证之前的结论，并且这种RNAi和overexpress配合“某处理因素作用”的实验结果可以为肿瘤治疗提供新的靶标，何乐而不为呢？
谢谢帮助，心中的困惑已经解开了
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