【求助】那位大侠用过CAMP测定试剂盒？急需帮忙
丁香园论坛
4918
你好！最近用R&D公司的CAMP测定试剂盒测细胞内CAMP的浓度，但是细胞一直裂解不好！我是按照试剂盒的说明书上操作的，我反复冻融了四五次，裂解效果还是不理想！做出来的结果根本没有梯度！谢谢各位大侠了！急需帮忙！
请问您做出来了吗？我也买了RD试剂盒，预实验都不理想，值太低。楼主做时加IBMX了吗？
我08做过cAMP检测，当时是用的是PE公司的检测试剂盒，效果还不错。记得做的时候是需要加IBMX的，好像是抑制cAMP分解的
sunopal_5200 wrote:
请问您做出来了吗？我也买了RD试剂盒，预实验都不理想，值太低。楼主做时加IBMX了吗？
2010年用过CisBio和DiscoverX的，都比较稳定。
个人感觉关键还是细胞处理：
1. IBMX是肯定要加的；
2. 每次都要让细胞有好的状态，这个好的状态不是你在显微镜下看到细胞形态好就行，而是你平时培养要保持一致、规律。
3. 感觉反复冻融的方法去做cAMP检测，结果差异肯定存在，因为本来cAMP量就少，使用的方法都是信号放大的，差一点就差很多的。如果非要用，那么最好做到细胞的量一致、反复冻融的次数一样，总之，尽量多次实验操作一致。
个人感觉关键还是细胞处理：
1. IBMX是肯定要加的；
2. 每次都要让细胞有好的状态，这个好的状态不是你在显微镜下看到细胞形态好就行，而是你平时培养要保持一致、规律。
3. 感觉反复冻融的方法去做cAMP检测，结果差异肯定存在，因为本来cAMP量就少，使用的方法都是信号放大的，差一点就差很多的。如果非要用，那么最好做到细胞的量一致、反复冻融的次数一样，总之，尽量多次实验操作一致。
即将做cAMP测定，感谢楼主的发问，让我有幸学习了一把，个人觉得如果反复冻融效果不好话可以尝试用超声波裂解稀薄，效果可能会好一些。
请问各位大虾，这几种试剂盒能不能做组织的 啊？*了
夏日雨季 wrote:
请问各位大虾，这几种试剂盒能不能做组织的 啊？*了
当然，不同公司cAMP试剂盒灵敏度有些差异，这个也需要做好选择。
另外，选择这些试剂盒时还需要根据自己实验室的仪器配置来选择，例如Cisbio,跟PE公司的cAMP试剂盒是基于TR-FRET方法的，因此酶标仪必须有TRF跟FRET功能；Promega公司的试剂盒是化学发光的，因此仪器上需要有Luminescence;
DiscoverX的试剂盒也是测的Luminescence；其他一些公司就是Elisa试剂盒，这个大家就比较熟悉了。
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<strong>如何定量检测cAMP和cGMP</strong></center>
背景介绍
1958年Sutherland发现了cAMP(环磷酸腺苷)，并因此获得了1971年诺贝尔生理与医学奖[1].1963年Ashman发现了cGMP（环磷酸鸟苷）[2]。50年过去了，人们已明白cAMP、cGMP是在很多生理过程中发挥重要调节作用的第二信使分子。鸟苷酸环化酶可将GTP催化生成cGMP，cGMP可以被磷酸二酯酶水解成GDP。激活鸟苷酸环化酶和抑制磷酸二酯酶可以增加细胞内cGMP的含量。cGMP特异性磷酸二酯酶的抑制剂被用来治疗人类的某些疾病，比如cGMP特异性磷酸二酯酶类型5的抑制剂（伟哥和**）被用来治疗ED（勃起功能障碍）；腺苷酸环化酶将ATP催化生成cAMP，cAMP可以被磷酸二酯酶水解成ADP。激活腺苷酸环化酶和抑制磷酸二酯酶可以增加细胞内cAMP的含量。腺苷酸环化酶激活受体的阻断剂和cAMP特异性磷酸二酯酶的抑制剂被用来治疗人类的某些疾病，比如针对升高cAMP水平的b-肾上腺素受体的阻断剂被用于治疗心律失常、高血压、心肌梗塞和心力衰竭等疾病。
在五十年的研究历程中，从开始研究cAMP，cGMP在各种生理过程中的调节作用，到近几年与之相关的药物研发，药物筛选领域，人们一直在努力寻找一种快速、灵敏、特异性和可重复地定量检测cAMP和cGMP含量的方法。
检测方法演变
cAMP，cGMP分子量分别只有329.21和345.21，在机体内的含量极低，为p mol/L级别，用一般的分析方法无法测定。70年代一系列测定cAMP和cGMP的方法被发明出来，最基本的原理有三种：分别是竞争性蛋白质结合分析法[3]、放射性免疫分析法[4]和薄层色谱法[5]。在80年代，放射性免疫分析法得到了广泛的应用和改进，由于这种方法采用放射性核素标记，应用范围受到一定限制，为了进一步提高检测的灵敏度和操作的安全性，进入90年代又陆续发明了各种酶标记法和化学发光法的竞争性ELISA检测试剂盒，这一类检测方法的根本原理都是基于抗体抗原的免疫反应，所有这些试剂盒中采用的抗体全部是兔抗血清或者是经过特异亲和提纯之后的抗cAMP或cGMP的兔多抗，毫无疑问，兔多抗在约四十年的cAMP，cGMP定量检测中做出了巨大贡献，但同时它也有着明显的缺陷：
1，兔多抗对cAMP，cGMP的特异性不高，会与其他核苷类似分子发生交叉反应，尽管可以通过特异亲和提纯降低交叉，但仍然无法消除交叉；
2，兔多抗对cAMP和cGMP的亲和力受高浓度的二价阳离子（比如Mg2+和Ca2+）的影响；
3，兔多抗在制备的过程中存在个体差异和批间差异，难以保证检测数据的重复性；
4，兔多抗试剂盒在cAMP，cGMP样品的处理上也需要进行乙酰化处理，这与兔多克隆抗体制备方法有必然关系，如果不乙酰化将无法达到检测所需的灵敏度。
所以无论标记方法如何革新，不改进抗体，仍然不能从根本上迎来cAMP，cGMP定量检测的变革。
cAMP和cGMP单克隆抗体成功开发
NewEast Biosciences（纽斯特）公司的科学家经过两年的研发，筛选了4万多个克隆，终于从中发现了高特异性，高亲和力的cAMP和cGMP单克隆抗体。并成功构建了世界上唯一的基于单抗的cAMP和cGMP ELISA检测试剂盒。这个cAMP（cGMP）单抗对非乙酰化的cAMP（cGMP）的特异性识别能力是其对cGMP（cAMP）、ATP（GTP）以及其他核苷类似物识别能力的108倍以上，这相比于以往的多抗试剂盒大大提高了cAMP (cGMP) 检测的灵敏性和特异性，并且极大的降低了试剂盒的批间差异，提供了长久有效地可重复性检测，也彻底摆脱了繁琐的乙酰化过程和对科研人员健康不利的乙酰化挥发试剂。
该试剂盒一经推出，得到了学术界的广泛认可，几年来陆续发表论文十多篇。
已发表论文：
1. Castro, L. R., J. Schittl, et al. (2010). "Feedback control through cGMP-dependent protein kinase contributes to differential regulation and compartmentation of cGMP in rat cardiac myocytes." Circ Res 107(10): 1232-1240.
2. Guo, D., J. J. Zhang, et al. (2009). "Stimulation of guanylyl cyclase-D by bicarbonate." Biochemistry 48(20): 4417-4422.
3. Long, Y., Q. Li, et al. (2011). "Molecular analysis, developmental function and heavy metal-induced expression of ABCC5 in zebrafish." Comp Biochem Physiol B Biochem Mol Biol 158(1): 46-55.
4. Tseng, K. Y., A. Caballero, et al. (2011). "Inhibition of Striatal Soluble Guanylyl Cyclase-cGMP Signaling Reverses Basal Ganglia Dysfunction and Akinesia in Experimental Parkinsonism." PLoS One 6(11): e27187.
5. Zhang, Y., Y. Sun, et al. (2011). "Molt-inhibiting hormone from Chinese mitten crab (Eriocheir sinensis): Cloning, tissue expression and effects of recombinant peptide on ecdysteroid secretion of YOs." Gen Comp Endocrinol 173(3): 467-474.
6. Zheng, X., L. Ying, et al. (2011). "Role of sulfhydryl-dependent dimerization of soluble guanylyl cyclase in relaxation of porcine coronary artery to nitric oxide." Cardiovasc Res 90(3): 565-572.
7. Tsai, E. J., Y. Liu, et al. (2012). "Pressure-overload-induced subcellular relocalization/oxidation of soluble guanylyl cyclase in the heart modulates enzyme stimulation." Circ Res 110(2): 295-303.
8. Andre, L., J. Fauconnier, et al. (2012). "Subendocardial Increase in Reactive Oxygen Species Production Affects Regional Contractile Function in Ischemic Heart Failure." Antioxid Redox Signal.
9. Makiya, M., M. Dolan, et al. (2011). "Structural basis of anthrax edema factor neutralization by a neutralizing antibody." Biochemical and Biophysical Research Communications. ???
10. Skrabalova, J., J. Neckar, et al. (2012). "Antiarrhythmic effect of prolonged morphine exposure is accompanied by altered myocardial adenylyl cyclase signaling in rats." Pharmacol Rep 64(2): 351-359.
11. Ying, L., X. Xu, et al. (2012). "Heterogeneity in relaxation of different sized porcine coronary arteries to nitrovasodilators: role of PKG and MYPT1." Pflugers Arch 463(2): 257-268.
参考文献:
1, Sutherland, et al. Cyclic AMP. Academic Press. Science 174, 392 (1971).
2, Ashman, et al, Biochem Biophys Res Commun, 11, 330 (1963).
3, Honma, M. et al., Biochem. Med.,18, 257 (1977).
4,Goldberg, M. L., Clin. Chem., 23, 576 (1977).
5, Trifilo, R. M. et al., J. Chromatogr., 116, 465 (1976).
背景介绍
1958年Sutherland发现了cAMP(环磷酸腺苷)，并因此获得了1971年诺贝尔生理与医学奖[1].1963年Ashman发现了cGMP（环磷酸鸟苷）[2]。50年过去了，人们已明白cAMP、cGMP是在很多生理过程中发挥重要调节作用的第二信使分子。鸟苷酸环化酶可将GTP催化生成cGMP，cGMP可以被磷酸二酯酶水解成GDP。激活鸟苷酸环化酶和抑制磷酸二酯酶可以增加细胞内cGMP的含量。cGMP特异性磷酸二酯酶的抑制剂被用来治疗人类的某些疾病，比如cGMP特异性磷酸二酯酶类型5的抑制剂（伟哥和**）被用来治疗ED（勃起功能障碍）；腺苷酸环化酶将ATP催化生成cAMP，cAMP可以被磷酸二酯酶水解成ADP。激活腺苷酸环化酶和抑制磷酸二酯酶可以增加细胞内cAMP的含量。腺苷酸环化酶激活受体的阻断剂和cAMP特异性磷酸二酯酶的抑制剂被用来治疗人类的某些疾病，比如针对升高cAMP水平的b-肾上腺素受体的阻断剂被用于治疗心律失常、高血压、心肌梗塞和心力衰竭等疾病。
在五十年的研究历程中，从开始研究cAMP，cGMP在各种生理过程中的调节作用，到近几年与之相关的药物研发，药物筛选领域，人们一直在努力寻找一种快速、灵敏、特异性和可重复地定量检测cAMP和cGMP含量的方法。
检测方法演变
cAMP，cGMP分子量分别只有329.21和345.21，在机体内的含量极低，为p mol/L级别，用一般的分析方法无法测定。70年代一系列测定cAMP和cGMP的方法被发明出来，最基本的原理有三种：分别是竞争性蛋白质结合分析法[3]、放射性免疫分析法[4]和薄层色谱法[5]。在80年代，放射性免疫分析法得到了广泛的应用和改进，由于这种方法采用放射性核素标记，应用范围受到一定限制，为了进一步提高检测的灵敏度和操作的安全性，进入90年代又陆续发明了各种酶标记法和化学发光法的竞争性ELISA检测试剂盒，这一类检测方法的根本原理都是基于抗体抗原的免疫反应，所有这些试剂盒中采用的抗体全部是兔抗血清或者是经过特异亲和提纯之后的抗cAMP或cGMP的兔多抗，毫无疑问，兔多抗在约四十年的cAMP，cGMP定量检测中做出了巨大贡献，但同时它也有着明显的缺陷：
1，兔多抗对cAMP，cGMP的特异性不高，会与其他核苷类似分子发生交叉反应，尽管可以通过特异亲和提纯降低交叉，但仍然无法消除交叉；
2，兔多抗对cAMP和cGMP的亲和力受高浓度的二价阳离子（比如Mg2+和Ca2+）的影响；
3，兔多抗在制备的过程中存在个体差异和批间差异，难以保证检测数据的重复性；
4，兔多抗试剂盒在cAMP，cGMP样品的处理上也需要进行乙酰化处理，这与兔多克隆抗体制备方法有必然关系，如果不乙酰化将无法达到检测所需的灵敏度。
所以无论标记方法如何革新，不改进抗体，仍然不能从根本上迎来cAMP，cGMP定量检测的变革。
cAMP和cGMP单克隆抗体成功开发
NewEast Biosciences（纽斯特）公司的科学家经过两年的研发，筛选了4万多个克隆，终于从中发现了高特异性，高亲和力的cAMP和cGMP单克隆抗体。并成功构建了世界上唯一的基于单抗的cAMP和cGMP ELISA检测试剂盒。这个cAMP（cGMP）单抗对非乙酰化的cAMP（cGMP）的特异性识别能力是其对cGMP（cAMP）、ATP（GTP）以及其他核苷类似物识别能力的108倍以上，这相比于以往的多抗试剂盒大大提高了cAMP (cGMP) 检测的灵敏性和特异性，并且极大的降低了试剂盒的批间差异，提供了长久有效地可重复性检测，也彻底摆脱了繁琐的乙酰化过程和对科研人员健康不利的乙酰化挥发试剂。
该试剂盒一经推出，得到了学术界的广泛认可，几年来陆续发表论文十多篇。
已发表论文：
1. Castro, L. R., J. Schittl, et al. (2010). "Feedback control through cGMP-dependent protein kinase contributes to differential regulation and compartmentation of cGMP in rat cardiac myocytes." Circ Res 107(10): 1232-1240.
2. Guo, D., J. J. Zhang, et al. (2009). "Stimulation of guanylyl cyclase-D by bicarbonate." Biochemistry 48(20): 4417-4422.
3. Long, Y., Q. Li, et al. (2011). "Molecular analysis, developmental function and heavy metal-induced expression of ABCC5 in zebrafish." Comp Biochem Physiol B Biochem Mol Biol 158(1): 46-55.
4. Tseng, K. Y., A. Caballero, et al. (2011). "Inhibition of Striatal Soluble Guanylyl Cyclase-cGMP Signaling Reverses Basal Ganglia Dysfunction and Akinesia in Experimental Parkinsonism." PLoS One 6(11): e27187.
5. Zhang, Y., Y. Sun, et al. (2011). "Molt-inhibiting hormone from Chinese mitten crab (Eriocheir sinensis): Cloning, tissue expression and effects of recombinant peptide on ecdysteroid secretion of YOs." Gen Comp Endocrinol 173(3): 467-474.
6. Zheng, X., L. Ying, et al. (2011). "Role of sulfhydryl-dependent dimerization of soluble guanylyl cyclase in relaxation of porcine coronary artery to nitric oxide." Cardiovasc Res 90(3): 565-572.
7. Tsai, E. J., Y. Liu, et al. (2012). "Pressure-overload-induced subcellular relocalization/oxidation of soluble guanylyl cyclase in the heart modulates enzyme stimulation." Circ Res 110(2): 295-303.
8. Andre, L., J. Fauconnier, et al. (2012). "Subendocardial Increase in Reactive Oxygen Species Production Affects Regional Contractile Function in Ischemic Heart Failure." Antioxid Redox Signal.
9. Makiya, M., M. Dolan, et al. (2011). "Structural basis of anthrax edema factor neutralization by a neutralizing antibody." Biochemical and Biophysical Research Communications. ???
10. Skrabalova, J., J. Neckar, et al. (2012). "Antiarrhythmic effect of prolonged morphine exposure is accompanied by altered myocardial adenylyl cyclase signaling in rats." Pharmacol Rep 64(2): 351-359.
11. Ying, L., X. Xu, et al. (2012). "Heterogeneity in relaxation of different sized porcine coronary arteries to nitrovasodilators: role of PKG and MYPT1." Pflugers Arch 463(2): 257-268.
参考文献:
1, Sutherland, et al. Cyclic AMP. Academic Press. Science 174, 392 (1971).
2, Ashman, et al, Biochem Biophys Res Commun, 11, 330 (1963).
3, Honma, M. et al., Biochem. Med.,18, 257 (1977).
4,Goldberg, M. L., Clin. Chem., 23, 576 (1977).
5, Trifilo, R. M. et al., J. Chromatogr., 116, 465 (1976).
DiscoverX试剂盒很稳定，做 Gi 的antagonist是其优势，而且它做出来的曲线是随cAMP增加而上升的（cisbio等的都是下降的），便于理解。 Luminescence对仪器要求相对较低，适合实验室使用，目前国内好像上海未峰生物技术有限公司有独家代理这个产品的。
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