【求助】关于NF-kB的激活激活
丁香园论坛
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各位战友，关于NF-kB的激活，我查了一些资料，有人认为通过western研究P65的表达量可以反映NF-kB的激活。因为P65的磷酸化和IkB的磷酸化可以反映NF-kB的激活，我比较困惑的是到底采用western检测P65、磷酸化P65还是IkB呢？是检测胞浆中的蛋白吗？如果是检测P65，NF-kB激活时，P65是升高还是降低呢？谢谢！
1、提取细胞全蛋白，然后测定磷酸化的P65表达，如果表达增高，则说明NF-kB p65被激活，此时内参用总NF-kB。
2、分别提取细胞核以及胞浆蛋白，然后分别测定核内以及胞浆内的NF-kB的含量，评价NF-kB的转位情况。
如果既有磷酸化增高，也有核内NF-kB含量增高的话，则说明NF-kB被激活。
IkB是NF-kB的上有激活因子，也可以测定。
2、分别提取细胞核以及胞浆蛋白，然后分别测定核内以及胞浆内的NF-kB的含量，评价NF-kB的转位情况。
如果既有磷酸化增高，也有核内NF-kB含量增高的话，则说明NF-kB被激活。
IkB是NF-kB的上有激活因子，也可以测定。
我也做这方面的实验，有一些问题不明白，可以向您请教一下吗？我的qq是155356071期待中
下沙、magichunter您好！我也做这方面的实验，有一些问题不明白，可以向您请教一下吗？我的qq是155356071，邮箱是yanxiaodu@126.com期待中
各位战友好，我也做NF-KB的，能否加我QQ530656701大家互相学习
我也在做，其实用报告基因测测还是比较方便的！我用的就是Promega的双荧光报告基因系统测的！
magichunter wrote:
IkB是NF-kB的上有激活因子，也可以测定。
IKB 不能这么笼统地说是NF-KB上游的激活因子吧？P-IKB是它的激活因子，而IKB的总量应该在激活后下降。
xiongran wrote:
我也在做，其实用报告基因测测还是比较方便的！我用的就是Promega的双荧光报告基因系统测的！
我总觉得光一个报告基因是不是不能充分说明问题？我看的文献里都是结合EMSA或者western 说明问题的。
xiongran wrote:
我也在做，其实用报告基因测测还是比较方便的！我用的就是Promega的双荧光报告基因系统测的！
反应活性最有说服力的方法。
阿兰梦 wrote:
我总觉得光一个报告基因是不是不能充分说明问题？我看的文献里都是结合EMSA或者western 说明问题的。
方法越多越有说明力。
各位同学，我也是想测NF-kB活化程度，仓促中买了p-I-kB和NF-kB p65的抗体。结果看到magichunter师兄一番话十份后悔，我是不是应该买磷酸化p65的抗体，而不是磷酸化I-kB的抗体啊？偶尔见过有人说磷酸化I-kB存在的时间很短，要是磷酸化I-kB也能说明NF-kB二聚体活化的程度的话，我应该在什么时间点检测最好呢？我的模型是缺血再灌注损伤。多谢各位同学了。
bnrlzh wrote:
各位同学，我也是想测NF-kB活化程度，仓促中买了p-I-kB和NF-kB p65的抗体。结果看到magichunter师兄一番话十份后悔，我是不是应该买磷酸化p65的抗体，而不是磷酸化I-kB的抗体啊？偶尔见过有人说磷酸化I-kB存在的时间很短，要是磷酸化I-kB也能说明NF-kB二聚体活化的程度的话，我应该在什么时间点检测最好呢？我的模型是缺血再灌注损伤。
磷酸化I-kB存在的时间看刺激的不同，如果是lps，一般15min后就可以看见了。你刚开始做，可以多做些time course。
嗯，多谢byang0904啦!
准备开始做细胞实验啦！可是仔细想想实验设计顿时头疼——要观察磷酸化I-kB，需要消耗一批细胞找峰值时间点。但是我想在不同时间点（1、3、6小时）观察NF-kB的活性，是不是还得测不同时间点的磷酸化I-kB啊？在那几个时间点磷酸化I-kB还有意义吗？我太笨了，想不明白了。
我决定换抗体了，换磷酸化NF-kB是不是就不存在检测时间不同步的问题呢？
有好心战友帮忙想想吗？感激涕零！
MARK
这里有NFκB (p65) Rabbit Polyclonal和NFκB (p65) Mouse Monoclonal的产品链接：
http://www.hypercyte.com/product/showproduct.php?id=1316&lang=cn
http://www.hypercyte.com/product/showproduct.php?id=1315&lang=cn
http://www.hypercyte.com/product/showproduct.php?id=1316&lang=cn
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阿兰梦 wrote:
IKB 不能这么笼统地说是NF-KB上游的激活因子吧？P-IKB是它的激活因子，而IKB的总量应该 ...
的确有文章用IKB的降解来证明NFkB的活性。。。不过作者还是检测了p-p65磷酸化水平
请问前辈做免疫组化检测NF-kb,最终选取的是哪个指标？我今年开始做这个实验了，目前很纠结。。。
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