【求助】AKT剂量

请问有无人将AKT用作处理因素的，即将AKT作用于细胞后检测下游分子的变化，或者有无看过相关的文献啊？怎么确定用量和作用时间？

是不是没有人会这样做的？或者说这样做是行不通的？再请问大家有无AKT的激动剂，能够激活细胞内的AKT活性？

我也想了解，包括erk

我看过有些文献是用转染的方法将带有激活型的AKT转到细胞内，让AKT持续高表达，但这样做比较麻烦，而且我也不需其持续高表达，所以烦请各位帮忙帮忙，想想办法。

还是没有回复
看来是很少人做这个方面的了

如果需要将AKT作为处理因素的话，可以先将细胞用无血清培养基进行starve预处理，以降低P-AKT的基础水平，然后应用HGF、PDGF等细胞因子刺激，以再次激活AKT，同时应用干预因素来检测其与AKT的关系，这是解决您所说的问题最常用的方式。

至于直接引入AKT是不妥的，因为通常情况下，处理因素很少影响AKT的总量，影响的是p-AKT的量。

至于：


能否提供文献出处，篇名即可，一定仔细拜读！！因为我个人认为要想实现这一点，即转染P-AKT让其稳定表达很难，而且也是不太现实的，因为这种信号靶点蛋白的影响因素实在太多了。

十分感谢楼上的回复！！
那我还想请问HGF、PDGF直接作用于AKT吗？即它们之间的作用不需要其它分子的介导？
还有，我的实验设计是将AKT的某个可能上游分子利用dominant negative方法阻断了活性，再加入AKT观察其（上游分子）介导的作用能否恢复，从而证明其位于AKT的上游。那如果我加入HGF、PDGF就很难说明作用的恢复是由HGF、PDGF通过激活AKT介导还是HGF、PDGF通过激活其它途径介导的。请问大家对此有什么看法？
至于楼上提到的文献，我是在看综述发现的，至于综述引用的具体文献我未细看，我先把综述名发上来，请各位看了之后发表一下看法。
文献： Manning B D, Cantley L C. AKT/PKB signaling: navigating downstream.[J]. Cell,2007,129(7):1261-1274.
十分期待各位的回复！！！

还想请问AKT有无激动剂？即类似于PKC的激动剂PMA，PMA可直接激活PKC。

期待各位的回复啊！

在HGF、PDGF与AKT之间是肯定有其他分子介导的，至少你应该想到RTKs（receptor tyrosine kinases）。



关于你提供的文献，我已经认真学习，关于你曾提到的“有些文献是用转染的方法将带有激活型的AKT转到细胞内，让AKT持续高表达”在本综述中确有提及，但请注意描述的细节（见下图），其转染的是模拟磷酸化的突变的AKT，这种模拟的P-akt与真正的P-AKT是有很大区别的，就如文中所讲，其“lower activity than the myr-Akt derivatives but is constitutively active and PI3K independent”。但这对于你的研究情况是有应用价值的。

关于你的课题，你表述的很隐晦，这个可以理解。只能在推测中谈谈个人的粗浅见解，仅供参考：

1、你既然应用dominant negative方法阻断了“上游分子”活性的话，那么一定有个特定的刺激因素作为先导条件。这个刺激因素很重要，要知道信号转导是交织的网络，刺激因素本身影响过多，那么你的课题就无严谨可言了。

2、既然要转入激活的AKT，那么你势必要有该“上游分子”发挥作用的同时伴有AKT激活水平增多；dominant negative“上游分子”以后，在同种刺激因素下发现AKT激活水平降低；以及应用AKT抑制剂进行预处理后，发现在同种刺激因素下“上游分子”发挥的作用受影响的表象证据。

3、在1、2的基础上才能谈你所述的想法。你应用HGF、PDGF等因素确实影响你如此深入的研究，那么综述中所指的那个“模拟磷酸化的突变的AKT”比较适合这种情况，但如你所说，很是麻烦。另外，因为很多细节无从谈及，我只能说你的课题研究有一定难度。其实，在做到第二步的时候，你就可以推测性地做出结论了，第三步可看做是进一步的求证。



4、目前，我尚未在文献中看到AKT特定的激动剂，因为在实际研究中，多半是在讨论AKT激活的现象和意义，因为激活它的物质太多了，HGF、PDGF、Insulin、小剂量的化疗药物等等。

很高兴看到楼上的回复！看了你的两次回复，都让我有茅塞顿开之感。我是刚刚接触信号传导的研究的，所以问题问得可能过于肤浅，还望海涵和理解！
楼上的见解十分具有针对性，对我很有启发。
我的课题也就是这样设计的，跟楼上所提及的步骤一样。
在我的研究中：“上游分子”的激活，确实是有个特定的刺激因素作为先导条件，是VEGF。对于VEGF激活“上游分子”我已经证实，但VEGF是先激活“上游分子”还是AKT，这个也就是我要论证的。这里所说它为AKT“上游分子”，是我的课题预期结果。故我需验证当抑制或激活AKT活性时，对VEGF和“上游分子”作用的发挥是否有影响，从而定位AKT在该通路中的位置。这也就是我要激活AKT的原因所在。
再次感谢楼上的辛勤回复！谢谢！

我也受益匪浅，以前都是做行为多一些，现在要做机制了，很多都不太明白，通过这个讨论我也学到很多

请问能否加入PI3K的产物PIP3(Phosphatidylinositol (3,4,5)-trisphosphate ，3、4、5-三磷酸磷脂酰肌醇)和PIP2(phosphatidylinositol-4,5-bisphosphate ，二磷酸磷脂酰肌醇)来激活AKT?PIP3和PIP2有无商品化的试剂卖？有无相关文献这样做的？

不是很明白LZ所说的，既然你dominant negative“上游分子”，而又想着通过Akt的过量表达去影响上游相关分子？ 这样的目的实在让人不明白是要干嘛啊。 呵呵
你想用PIP3来激活Akt，可以理解，但问题是，这种脂质物质应该定位于细胞膜上时候才有活性，外源性加入，不一定发挥它的作用。
还有就是 PIP3的加入 也可能引起该通路上游的Pten的过度表达，从而Akt并不一定能够被高度激活吧。
如果是阻断上游通路，通过控制Akt激活状态或者其表达水平等，研究下游信号分子的变化，可能更好一些吧

该“上游分子”之所以叫上游分子，是我的预期实验结果它是位于Akt上游，但是这只是我的预期，在实验中我是要确证它是位于Akt上游的，所以我dominant negative“上游分子”，再去过量表达Akt，若“上游分子”无影响，那就是位于Akt上游的证据之一。

我就是想控制Akt的激活状态，但好像文献都只有把它活性抑制掉，而没有把它的活性提高。

文章修稿，之前用的是AKT的抑制剂来实验的，现在审稿回来要求用一下AKT的激活剂来处理，目前打算用胰岛素作为激动剂可以吗，在HepG2上做，有做过的吗 具体怎么做的，它的一个剂量？？