【求助】脂多糖激活MAPK通路后如何终止？
丁香园论坛
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我做的课题需要用脂多糖来激活MAPK通路，并且分别在激活5m，10m，15m，30m，60m后检测，加入脂多糖的时候应该是在无菌操作台中操作，因为外面空气中有细菌，也就是说有脂多糖，会影响实验结果，在加入脂多糖后，时间点到了，比如说已经到了5m或10m，这时候该如何终止反应呢？用生理盐水清洗然后加入细胞裂解液裂解细胞，是这样地吗？那么这个过程在什么环境中操作呢?如果加入脂多糖到了时间点后就把培养皿拿出超净台，在外面用生理盐水清洗，然后加入细胞裂解液的话，会不会存在空气中细菌脂多糖的污染问题，但是在超净台中操作的话，一个是时间长，在一个空间比较小操作不是很方便，不知道有没有类似经验的战友啊！请高手指教，我是菜鸟，不胜感激！！！！！！！！！！
可以将反应体系放在冰上终止反应，并用预冷的PBS清洗，然后尽快加入预冷的裂解液。这以后是可以拿出超净台的。
楼上的战友：
您好！
看到您的回复，非常的及时，很感谢您！还想请教您一下
1.为什么终止反应的时候要放在冰上呢？
2.也要将冰拿进超净台吗？
3.我的理解是这样，不知道对不对，在超净台中加入脂多糖，时间点到了之后，在超净台中用PBS清洗，并且加入裂解液，然后拿出超净台放在冰上，提取蛋白，是这样的吗？
我是菜鸟，请多指教，不胜感激！！！！
顺祝 一切顺利！！！！！
您好！
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1.为什么终止反应的时候要放在冰上呢？
2.也要将冰拿进超净台吗？
3.我的理解是这样，不知道对不对，在超净台中加入脂多糖，时间点到了之后，在超净台中用PBS清洗，并且加入裂解液，然后拿出超净台放在冰上，提取蛋白，是这样的吗？
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nulidaodi wrote:
楼上的战友：
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1.为什么终止反应的时候要放在冰上呢？
2.也要将冰拿进超净台吗？
3.我的理解是这样，不知道对不对，在超净台中加入脂多糖，时间点到了之后，在超净台中用PBS清洗，并且加入裂解液，然后拿出超净台放在冰上，提取蛋白，是这样的吗？
我是菜鸟，请多指教，不胜感激！！！！
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不是那个样子。
放在冰上不是必须的，只是低温下大多数反应会减慢（lps的刺激反应），所以时间点到了后，用从4度冰箱刚拿出来的PBS直接洗也没有问题（只要你的操作不是特～别～慢），然后该干嘛干嘛就可以的。
感谢楼上的回复，加入脂多糖之后，是不是就可以拿出超净台了啊!以后用PBS洗和加细胞裂解液在超净台内还是外进行啊！不胜感激！！！
nulidaodi wrote:
感谢楼上的回复，加入脂多糖之后，是不是就可以拿出超净台了啊!以后用PBS洗和加细胞裂解液在超净台内还是外进行啊！不胜感激！！！
我个人习惯
1. 在超净台加入脂多糖
2. 到了时间，用刚从冰箱拿出来的PBS洗
3. 加入细胞裂解液
4. 拿出超净台
5. 该干嘛干嘛 :D
加脂多糖甚至都可以在外面，加完后放回孵箱，到时间后拿出来用预冷的PBS洗涤，然后放在冰上加裂解液。因为你是检测MAPK通路的活化，所以从裂解直到蛋白上清加入loading buffer之前都必须置于冰上，裂解液中要加入蛋白酶和磷酸酶抑制因子。收样要快。
中止的标志是用脂多糖洗过之后呢还是加了裂解液之后呢？我是觉得应该是加入了裂解液后才是真正的中止吧！我最近作了一下，以1.undefined10的六次方接种到60mm培养皿中孵育24小时后，用刺激物刺激5，10，15，30分钟后分别提蛋白，刺激的时间到了之后，先用PBS清洗，然后加入裂解液，但是遇到一个问题，加入200微升的裂解液感觉不能完全淹没皿底的细胞，如果用枪吹打得话，因为每个皿提蛋白的时间只有五分钟，光吹打就要花去几分钟，也就是说真正裂解细胞中止刺激反应的时间误差就会比较大，但是如果裂解液加多了，蛋白的浓度又会比较稀，这个问题怎么解决呢？请有经验的战友帮忙指点一下，不胜感激！！！！顺祝实验顺利！！！！！
自己顶一下，请大家帮忙！！！！
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