【求助】脂多糖激活MAPK通路后如何终止?
丁香园论坛
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我做的课题需要用脂多糖来激活MAPK通路,并且分别在激活5m,10m,15m,30m,60m后检测,加入脂多糖的时候应该是在无菌操作台中操作,因为外面空气中有细菌,也就是说有脂多糖,会影响实验结果,在加入脂多糖后,时间点到了,比如说已经到了5m或10m,这时候该如何终止反应呢?用生理盐水清洗然后加入细胞裂解液裂解细胞,是这样地吗?那么这个过程在什么环境中操作呢?如果加入脂多糖到了时间点后就把培养皿拿出超净台,在外面用生理盐水清洗,然后加入细胞裂解液的话,会不会存在空气中细菌脂多糖的污染问题,但是在超净台中操作的话,一个是时间长,在一个空间比较小操作不是很方便,不知道有没有类似经验的战友啊!请高手指教,我是菜鸟,不胜感激!!!!!!!!!!
可以将反应体系放在冰上终止反应,并用预冷的PBS清洗,然后尽快加入预冷的裂解液。这以后是可以拿出超净台的。
楼上的战友:
您好!
看到您的回复,非常的及时,很感谢您!还想请教您一下
1.为什么终止反应的时候要放在冰上呢?
2.也要将冰拿进超净台吗?
3.我的理解是这样,不知道对不对,在超净台中加入脂多糖,时间点到了之后,在超净台中用PBS清洗,并且加入裂解液,然后拿出超净台放在冰上,提取蛋白,是这样的吗?
我是菜鸟,请多指教,不胜感激!!!!
顺祝 一切顺利!!!!!
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1.为什么终止反应的时候要放在冰上呢?
2.也要将冰拿进超净台吗?
3.我的理解是这样,不知道对不对,在超净台中加入脂多糖,时间点到了之后,在超净台中用PBS清洗,并且加入裂解液,然后拿出超净台放在冰上,提取蛋白,是这样的吗?
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nulidaodi wrote:
楼上的战友:
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1.为什么终止反应的时候要放在冰上呢?
2.也要将冰拿进超净台吗?
3.我的理解是这样,不知道对不对,在超净台中加入脂多糖,时间点到了之后,在超净台中用PBS清洗,并且加入裂解液,然后拿出超净台放在冰上,提取蛋白,是这样的吗?
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不是那个样子。
放在冰上不是必须的,只是低温下大多数反应会减慢(lps的刺激反应),所以时间点到了后,用从4度冰箱刚拿出来的PBS直接洗也没有问题(只要你的操作不是特~别~慢),然后该干嘛干嘛就可以的。
感谢楼上的回复,加入脂多糖之后,是不是就可以拿出超净台了啊!以后用PBS洗和加细胞裂解液在超净台内还是外进行啊!不胜感激!!!
nulidaodi wrote:
感谢楼上的回复,加入脂多糖之后,是不是就可以拿出超净台了啊!以后用PBS洗和加细胞裂解液在超净台内还是外进行啊!不胜感激!!!
我个人习惯
1. 在超净台加入脂多糖
2. 到了时间,用刚从冰箱拿出来的PBS洗
3. 加入细胞裂解液
4. 拿出超净台
5. 该干嘛干嘛 :D
加脂多糖甚至都可以在外面,加完后放回孵箱,到时间后拿出来用预冷的PBS洗涤,然后放在冰上加裂解液。因为你是检测MAPK通路的活化,所以从裂解直到蛋白上清加入loading buffer之前都必须置于冰上,裂解液中要加入蛋白酶和磷酸酶抑制因子。收样要快。
中止的标志是用脂多糖洗过之后呢还是加了裂解液之后呢?我是觉得应该是加入了裂解液后才是真正的中止吧!我最近作了一下,以1.undefined10的六次方接种到60mm培养皿中孵育24小时后,用刺激物刺激5,10,15,30分钟后分别提蛋白,刺激的时间到了之后,先用PBS清洗,然后加入裂解液,但是遇到一个问题,加入200微升的裂解液感觉不能完全淹没皿底的细胞,如果用枪吹打得话,因为每个皿提蛋白的时间只有五分钟,光吹打就要花去几分钟,也就是说真正裂解细胞中止刺激反应的时间误差就会比较大,但是如果裂解液加多了,蛋白的浓度又会比较稀,这个问题怎么解决呢?请有经验的战友帮忙指点一下,不胜感激!!!!顺祝实验顺利!!!!!
自己顶一下,请大家帮忙!!!!
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