【求助】细胞侵袭
丁香园论坛
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请教各位高手,我做的侵袭实验,小室在倒置显微镜下怎么放呢,是正置即内膜朝上,还是倒置即外膜面朝上?我两者均看了,只能正置时看到细胞即内膜面,外膜面什么也看不到.请高手指点,我这是没穿过?还是在倒置显微镜下观察看到的就是穿到外膜面的细胞?谢谢!很急!
内膜面的细胞擦掉后看到的就只有穿到外膜面的细胞了
可以取出小室正置放于6孔板内,湿棉签把内膜上的细胞擦掉,就能看到穿过膜的细胞了。
倒置即外膜面朝上
Transwell小室的准备:
购买的小室有两种,一种是已铺好基质胶的,买来就可以用很方便,但也比较贵;另一种要自己铺胶(层黏连蛋白和Ⅳ型胶原 ),价格较便宜。
(1)从-20℃冰箱中取出小室在超净台内将其放入24孔板,室温放置。
(2)在24孔板和小室内各加入500L予热的无血清培养基,37℃孵箱中水化2h。
(3)水化后,用移液器小心地将小室内液体移出,不要碰到基底膜。
(4)将 受检细胞全培养基终止消化,细胞计数,将细胞稀释到10万/mL浓度备用(培养液含0.2-1%血清)。
(5)24孔板内加入750L全培养基(培养液含10-15%血清)之后,将小室放入24孔板中,注意小室膜下不要产生气泡,如产生气泡应去除。
(6)迅速加入500L以备细胞悬液(5万个细胞/孔),每组细胞设3个复孔。吹打均匀,镜下观察。
(7)37℃孵箱中,培养24h。
(8)从24孔板中取出小室,去掉液体用棉签蘸无血清培养基擦干净膜的内表面,去掉未发生侵袭的细胞。
(9)膜在无水甲醇中固定1min,水洗2遍;苏木素染色5min,水洗干净(至无色);伊红染色20sec,水洗干净。
(10)将小杯子上的膜完全晾干。
(11)用手术刀将膜完整地切下,中性树胶将膜粘到载玻片上,盖上盖玻片。
(12)光镜下观察,计数,拍照。
购买的小室有两种,一种是已铺好基质胶的,买来就可以用很方便,但也比较贵;另一种要自己铺胶(层黏连蛋白和Ⅳ型胶原 ),价格较便宜。
(1)从-20℃冰箱中取出小室在超净台内将其放入24孔板,室温放置。
(2)在24孔板和小室内各加入500L予热的无血清培养基,37℃孵箱中水化2h。
(3)水化后,用移液器小心地将小室内液体移出,不要碰到基底膜。
(4)将 受检细胞全培养基终止消化,细胞计数,将细胞稀释到10万/mL浓度备用(培养液含0.2-1%血清)。
(5)24孔板内加入750L全培养基(培养液含10-15%血清)之后,将小室放入24孔板中,注意小室膜下不要产生气泡,如产生气泡应去除。
(6)迅速加入500L以备细胞悬液(5万个细胞/孔),每组细胞设3个复孔。吹打均匀,镜下观察。
(7)37℃孵箱中,培养24h。
(8)从24孔板中取出小室,去掉液体用棉签蘸无血清培养基擦干净膜的内表面,去掉未发生侵袭的细胞。
(9)膜在无水甲醇中固定1min,水洗2遍;苏木素染色5min,水洗干净(至无色);伊红染色20sec,水洗干净。
(10)将小杯子上的膜完全晾干。
(11)用手术刀将膜完整地切下,中性树胶将膜粘到载玻片上,盖上盖玻片。
(12)光镜下观察,计数,拍照。
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