肿瘤细胞侵袭试验（Tumour Invasion Assay）

一、原理

Matrigel 是从小鼠EHS肉瘤中提取的基质成分，含有LN、IV型胶原、接触蛋白和肝素硫酸多糖，铺在无聚乙烯吡硌烷酮的聚碳酸酯滤膜上，能在DMEM培养基中重建形成膜结构，这种膜结构与天然基质膜结构极为相似。

滤膜孔径一般为8um，而且膜孔都被Matrigel覆盖，细胞不能自由穿过，必须分泌水解酶，并通过变形运动才能穿过这种铺有Martrigel的滤膜，这与体内情况较为相似。

铺有Martrigel的滤膜放在以Blind Well腔或MICS腔上下室之间，铺有Martrigel面朝向上室，在下室中加有趋化剂，如一定浓度的LN、FN或小鼠3T3条件培养液或人睾丸上皮成纤维细胞培养液，上室加入重悬的瘤细胞，具有侵袭能力的细胞在趋化剂诱导下开始穿膜运动。细胞穿膜所用的时间与Martrigel的用量有关，选择25ugMartrigell铺膜，16小时后观察结果较为合适。穿过滤膜的细胞多数粘附在滤膜下表面，可用棉签将上表面的细胞拭去，然后用乙醇固定滤膜，PE染色，在光镜下观察统计穿过Martrigel的细胞数。

另外用Transwell小室也可进行重建基质膜侵袭分析，这一方法是在Transwell小室吊篮式上腔的滤膜上铺上30ugMartrigel，加入细胞72h后观察结果。值得注意的是，细胞在TransWll腔中培养72小时后，有相当数量穿过滤膜的细胞不再粘附在滤膜下表面，而是脱落进人下腔溶液中．因此统计穿过基质膜的细胞数目时应把这部分细胞考虑在内。肿瘤细胞穿过重建基质膜的能力与它的体内侵袭转移能力表现出较好的相关性，可以用重建基质膜模型初筛抗侵袭药物。

在上述分析中，如果不在膜上铺Martrigel而直接将8um孔径滤膜安放在侵袭腔室上下腔室之间，细胞通过变形运动穿过滤膜，用这种模型对分析细胞运动能力和药物对细胞运动能力的影响。另外，在下室中加有LN或FN或在滤膜下表面铺上LN或FN，可分析药物对肿瘤细胞的趋化性或趋固性的影响。

二、材料

1、Matrigel 基质胶（威格拉斯生物技术（北京）有限公司），10mg/ml，5ml，分装成0.5ml/只10个EP管中；用时加入0.5ml的DMEM；Matrivgel在冰上维持液态，室温时可迅速凝结成胶。使用前应从-20℃转移至4℃待其自然溶化（如过夜放置），避免反复冻融。使用时需接触Matrivgel的试管、移液吸头等均应预冷于4℃；注意无菌操作；

2、24-transwell (Coster)；

3、结晶紫染料溶液：结晶紫用甲醇配成0.5%的母液，使用浓度为0.1％，用PBS按1：4稀释后即为染色液；

4、33%醋酸；

三、实验步骤

1、溶液配制：

（1）溶DMEM 500ml；

NE---A液（1μg/μl，1mg/ml）

母液0.1ml（5mg）+ ddH2O up to 5 ml ；过滤消毒，-20℃保存。

NE-DMEM（-6M）

NE---A液（1μg/μl，1mg/ml） 20.5μl

DMEM UP TO 100 ml

过滤消毒，4℃保存

（2）NE+CGRP-DMEM（-6M，100ng）

NE---A液（1μg/μl，1mg/ml） 20.5μl

CGRP-储存液 50 μl

DMEM UP TO 100 ml

过滤消毒，4℃保存

（3）NE+IFN-DMEM（-6M，50ng）

NE---A液（1μg/μl，1mg/ml） 20.5μl

IFN-γ（25ng/μl） 25 μl

DMEM UP TO 100 ml

过滤消毒，4℃保存

（4）低血清DMEM培养基（上室）

（5）20%FBS-DMEM培养基（下室）

2、准备

（1）溶胶，4℃过夜（Thaw Matrigel at 4℃ overnight.）

（2）室温下基质胶易成凝胶，所以，步骤2和3种使用试管和枪头要在试验前-20C预冷。（Matrigel tends to form gel very quickly at room temerature, therefore, pipets and tips using in steps 2 and 3 have to be chilled at prior to experiements.）

3、包被基底膜（冰上操作）

（1）用无血清的冷细胞培养基DMEM稀释Matrigel胶（10mg/ml to 5 mg/ml)） （Dilute Matrigel (10mg/ml to 5 mg/ml) in serum free-cold cell culture media (RPMI1640, EMEM, DMEM, etc).）

（2）取100ul稀释胶加到24-well transwell上室中 （Put 100 ul of the diluted matrigel into upper chamber of 24-well transwell）

（3）37℃孵育transwell至少4-5h （Incubate the transwell at 37C at least 4 to 5 h for gelling.）

4、水化基底膜

用无血清培养基轻洗凝胶 （Gently wash gelled matrigel with warmed serum free-culture media.）

5、准备细胞悬液和小室

（1）消化法从细胞培养瓶中获取细胞； （Harvest cells from tissue culture flasks by Trypsin/EDTA；）

（2）用培养基洗3遍（Wash the cells 3 times with culture media (RPMI1640, EMEM, DMEM etc) containing 1 % FBS.）

（3）重悬细胞，5×105 cells/ml，1% FBS （Resuspend the cells in media containing 1% FBS at a density of 5×105 cells/ml.）

（4）上室加200 ul细胞悬液 （Put 200 ul of the cell suspension onto the matrigel.）

（5）下室中加入600 ul细胞培养基，含有5 ug/ml fibronectin作为黏连亚族 （lower chamber of the transwell is filled with 600 ul of culture media containing, as an adhesive subtrate.）

6、孵育，37℃，20 to 24 h （Incubate at 37C for 20 to 24 h.

7、染色和计数

（1）棉签擦去上室上面的非侵袭细胞（Scrape off noninvaded cells on the top of the transwell with a cotton swab）

（2）移去transwells，倒置，风干（Remove transwells from 24-well plates and stained with Diff-Quick solution.）

（3）24孔板中加入500µl含0.1%结晶紫，将小室置于其中，使膜浸没在培养基中，37℃ 30min后取出，PBS清洗。

（4）直径上取4个视野，照相，计数。

（5）24孔板中加入500µl 33%醋酸，将小室置于其中，浸膜，振荡10min，充分溶解。取出小室，24孔板于酶标仪上570nm测OD值，间接反应细胞数。

小技巧：照相前一定要晾干，照相时将小室正置于载玻片上，在倒置显微镜下观察、照相。经济、实用、方便。