【求助】新手 请问western-blot测NF-KB、FLT3是用总蛋白提取试剂盒吗

各位大侠：
小弟是新手，师兄们也没做过的，不知western-blot测NF-KB、FLT3是用总蛋白提取试剂盒吗？急盼回复！万分感谢！

我用过总蛋白提取试剂盒提蛋白，之后western-blot检测NF-KB，但是感觉这样得到的蛋白浓度很稀，需要比较大的上样量才能检测出来，个人感觉，还是用传统的细胞匀浆裂解，离心提取上清，这样得到的蛋白浓度大，做试验结果好

自己配置RIPA即可

问题是检测NF-KB是为了说明什么？
检测NF-KB的总量意义不大，因为不能反映NF-KB的活化。
如果是要反映NF-KB活性增强，那要提取核蛋白来检测

十分感谢上面各位大侠的帮忙！小弟需要用western-blot测骨髓单核细胞flt3。用Millipore的抗体，该公司提供三种抗体，Anti-Flt-3, extracellular region; 200 µg /Anti-Flt-3, cytoplasmic domain; 200 µg /Flt-3 Ligand, recombinant human; 10 µg 。不知道用那一种好！可惜我是搞临床的，免疫和分子生物学很差，知道不多，问了该公司技术支持，也没说出什么，建议查参考文献。东查西查也没有弄清？急盼各位高手给答案。万分感谢！

看了你描述的三种抗体，推测flt3是一种膜受体吧，不知猜得对不对？
Anti-Flt-3, extracellular region，是针对flt3胞外段的抗体
Anti-Flt-3, cytoplasmic domain，是针对flt3胞内段的抗体
Flt-3 Ligand, recombinant human，是重组的Flt-3的配体，如果能作为抗体用的话应该是针对flt3的活性位点。不过如果是做western-blot的话，由于要蛋白要变性，变性后活性位点是否还存在不得而知，最好不要用这种，而且这种量少啊，才10 µg，估计比较贵吧。
Anti-Flt-3, extracellular region，和Anti-Flt-3, cytoplasmic domain应该都是合适的，哪个便宜就用哪个吧

十分感谢lwjssry 的帮忙！
Flt3属于3型受体酪氨酸激酶佳作（RTK），编码1000氨基酸的蛋白质，其结构有胞外区、跨膜区、和胞内区三部分组成。This gene encodes a class III receptor tyrosine kinase that regulates hematopoiesis. The receptor consists of an extracellular domain composed of five immunoglobulin-like domains, one transmembrane region, and a cytoplasmic kinase domain split into two parts by a kinase-insert domain. The receptor is activated by binding of the fms-related tyrosine kinase 3 ligand to the extracellular domain, which induces homodimer formation in the plasma membrane leading to autophosphorylation of the receptor. The activated receptor kinase subsequently phosphorylates and activates multiple cytoplasmic effector molecules in pathways involved in apoptosis, proliferation, and differentiation of hematopoietic cells in bone marrow. Mutations that result in the constitutive activation of this receptor result in acute myeloid leukemia and acute lymphoblastic leukemia. 今天去找了位老师帮忙，老师说感觉两个都行。其中Anti-Flt-3, cytoplasmic domain 的Molecular Weight: premature (130kDa) and the mature form (155kDa)；Immunogen: His-tag fusion protein corresponding to residues 786-1000 of mouse Flt3 。而Anti-Flt-3, extracellular region 的Molecular Weight:155kDa （mature form of Flt3 ）。让再查查pubMed。不知上面的大侠有何建议？

各位大侠，我若用分泌物来做信号转导的话，标本得处理有要求吗？是取后直接离心，上清液弃去，留沉淀后放在-80度的冰箱吗？若检测核因子必须的提取RNA吗？DNA不行吗？

不知道fanaipinger做什么类型实验？EMSA？western-blot？RT-PCR?其他？

我想提取DNA，这样能做EMSA或western-blot吗？因提取RNA太烦琐，标本取出后得直接低温保存，我们这里没低温冰箱，且RNA容易降解。我的目的是用THP-1细胞进行核因子荧光素酶基因报告系统转染后，用脂多糖及炎性分泌物等刺激，看核因子的表达是否升高。DNA能做定量PCR吗?

我想提取DNA，这样能做EMSA或western-blot吗？因提取RNA太烦琐，标本取出后得直接低温保存，我们这里没低温冰箱，且RNA容易降解。我的目的是用THP-1细胞进行核因子荧光素酶基因报告系统转染后，用脂多糖及炎性分泌物等刺激，看核因子的表达是否升高。DNA能做定量PCR吗?

请问下，能否只提取总蛋白用western bot测NF-kBP65 和P-NF-kB P65来反映NF-kB活性，我是这样想的，测总p65可说明刺激不影响总p65前提下改变了活化状态的p65（p-NF-kB P65)，而非改变总p65的量而引起，还有可以我可以用荧光测p65来反映核转位，不知我的理解正确与否？

P-NF-kB P65？请问P65的活性调控是通过磷酸化和去磷酸化吗？

我用IL-1b刺激NF-kB活化，下面来自CST公司的图也说明活化的NF-KB呈磷酸化形式然后入核，园子里也有类似评论（http://www.dxy.cn/bbs/post/view?bid=74&id=7500744&sty=2如下：

园子里类似评论http://www.dxy.cn/bbs/post/view?bid=74&id=7500744&sty=2,很疑惑？？？？？

不知道这个帖子后来又有了跟帖，今天银杏树战友专门pm，我偶然发现，再回答一下吧
xiaobaibai wrote:
选择胞浆内参，是指胞浆IKB和细胞总蛋白的P65各自再做内参吗？选胞浆内参（actin、tublin......）?不知道我理解的对不对？

银杏树 wrote:
1 为什么要用细胞总蛋白做p65,而不用胞核蛋白呢?这样胞浆的IKBα的水平和胞核NF-κB的水平是不是也可以的?
2 有些因子是通过促进P65核转位（自IkB解离，而IkB量并不变）,就是说IKB自解离,那实际上在NF-κB入核的过程中,胞浆的IKB用western做是不是也应该增加啊? 还是说在IKB没解离前,一抗就能和IKBα结合?

1 测NFkB活性变化，对于非磷酸化抗体，必须做核蛋白的western或EMSA，这是反映NFkB有无功能改变；如果核蛋白有变化，则进一步寻求这个核转位的起因，需：
2:
a 针对p65活化（磷酸化），使用磷酸化的抗体，做总蛋白。某种意义说与1是近似等同的。p65先磷酸化，然后自IkB解离，之后入核。
b 针对IkB减少引起的（转录减少/mNRA降解加快/蛋白降解速度增加），做IkB胞浆蛋白表达变化（总蛋白也可以，因为IkB并不入核）
c 针对p65表达量增加引起的（转录增加/增强mRNA稳定性使半衰期延长/蛋白降解减少），做p65总蛋白。

所以做第1步足以说明问题，很多文章做到这一步就可以停止了，因为大家更关心NFkB下游的效应基因表达变化是由什么因素引起的（即是否由NFkB活化引起的）。但如果你为了做更深一点，寻找NFkB活化的起因，则可以行后面的。

对于xiaobaibai 的问题这样回答
可以做总蛋白的IkB和P65，这样免得再提胞浆蛋白了，IkB胞浆和总蛋白是一致的，选择actin或tubulin做内参

对于银杏树 的问题这样回答：
1 指做过胞核蛋白以后发现阳性，然后做总蛋白看有无P65总表达量的变化，所以做的是总蛋白，余见上述
2 IkB相当于把P65捆绑在胞浆，P65活化后IkB虽然与P65解离，但本身并不降解，所以虽然游离的IkB是增加了，但胞浆表达总量并不变化。western要使用SDS变性，蛋白亚基之间是分开的，不能反映在活体细胞二者结合与否，仅能反映量的多少。所以western做IkB，解离还是不解离IkB在胞浆的总量都是一样的，所以是没有变化的。

为人为己，特此更正上面的错误,在下面简单叙述一下：
磷酸化改变的是IkB而非P65，反映转录激活的抗体是识别p65暴露位点而非磷酸化位点。

p50 亚基含有核定位信号区，负责核转位，与转录无关；RelA亚基（P65）含有DNA 结合域，负责结合启动子改变下游基因转录；最常见的作用形式是P65和P50亚基组成的NFκB异源二聚体， IkB与此二聚体结合形成三聚体，保持三聚体存在于胞浆中从而抑制激活。
激活：当诱导因子刺激时，IkB磷酸化而被降解从三聚体中解离出来,暴露出p50 亚基上的易位信号和p65 亚基上的DNA 结合位点,p65/p50二聚体借助p50从细胞质中易位到细胞核中,借助p65与kB 基序相结合,从而发挥转录调控作用。
1 细胞因子(如TNF-a 、IL-1)：依赖IkB Ser 磷酸化途径　；此反应十分迅速, 实验证实在 5min 左右即可使NFkB 的活性水平达到峰值
2 紫外线、内毒素、氧化应激：依赖IkB Tyr 磷酸化途径

NFkB 的失活：IkB启动子含有kB 基序,因此NFkB 被活化后可以上调IkB的表达,这些新生成的IkB,一方面可与游离的NFkB 结合,重新使NFkB 的活性被抑制;另一方面,可进入细胞核,具有自核内向核外输出NFkB 的功能。

yaplewang 版主太牛了顶一下

支持lwjssry
相信lwjssry是高手，我问过他很多问题！
对于 myskyld，还有转的银杏叶的帖子，他们的解答都是有错误的。
首先，myskyld对于NF-kB的磷酸化，是存在的，但是不是只有NF-kB磷酸化之后才入核。CST给的抗体是有磷酸化。NF-kB是有6个位点的磷酸化的，但是，每次不同的刺激都会产生不同位点的磷酸化，而不是每次都是同样的。磷酸化不是NF-kB激活的必须条件，另外NF-kB入核前，还有可能有乙酰化的改变。磷酸化和乙酰化都是可能使NF-kB激活更强，不是只有磷酸化才激活，请明白NF-kB为什么磷酸化。（后面会给出cell杂志08年的NF-kB的综述，请阅读）
银杏叶的错误观点：
"a 针对p65活化（磷酸化），使用磷酸化的抗体，做总蛋白。某种意义说与1是近似等同的。p65先磷酸化，然后自IkB解离，之后入核。
c 针对p65表达量增加引起的（转录增加/增强mRNA稳定性使半衰期延长/蛋白降解减少），做p65总蛋白。"
磷酸化是完全不可以与入核相比的，没有哪一篇高质量的SCI会用磷酸化代替入核的。P65的表达意义不大，因为P65不入核，表达再多，也是无用的。所以，总蛋白很多文献是不做的，但是核蛋白是一定要做的。
银杏叶的错误回答：“2 IkB相当于把P65捆绑在胞浆，P65活化后IkB虽然与P65解离，但本身并不降解，所以虽然游离的IkB是增加了，但胞浆表达总量并不变化。western要使用SDS变性，蛋白亚基之间是分开的，不能反映在活体细胞二者结合与否，仅能反映量的多少。所以western做IkB，解离还是不解离IkB在胞浆的总量都是一样的，所以是没有变化的。”
这里反了严重的错误，对于NF-kB的基本常识都没有弄清。IkB是细胞内P65的抑制剂，只有IkB磷酸化并随之降解之后，P65才能解离，否则P65无法发挥作用。IkB是降解的，不是游离的，随便看做IkB一篇SCI都会观察到IkB的减少。

如有疑问，请参阅这篇cell综述
并且有些NF-kB磷酸化位点起什么作用至今仍未搞清楚，怎么能用来代替入核看激活。

在此支持lwjssry 高手，和感谢他多次热心的帮助。

您好，我买了cst公司的NF-KB P65、p-NF-KB P65、IKB-a抗体，我是检测这条通路是否激活了，是不是都需要提取核蛋白做啊？还是只提取总蛋白就可以了？

你好，我想检测NF-KB通路是否激活了，我只做 NF-KB P65、p-NF-KB P65、IKB-a的western blot 可以吗？能反映出这条通路被活化了吗？

是核蛋白和总蛋白都做了吗？