伯豪生物 450k 甲基化芯片及焦磷酸测序服务助力皮肤病领域取得表观遗传学研究重磅成果！

2016年1月19日，国际着名医学期刊《Annals of the Rheumatic Diseases》（影响因子10.377,风湿病领域排名第1）发表中南大学湘雅二医院陆前进教授研究团队对系统性红斑狼疮的研究成果。陆教授团队经过3年的艰苦努力，研究开发出一种特异性高、敏感性强系统性红斑狼疮新型诊断标志物，在国际上首次将对该疾病的诊断提升到基因水平。

伯豪生物华南区销售技术团队在研究过程中的通力合作也得到了陆教授团队的认可，伯豪生物会更加努力协助更多老师取得更大的科研成果。

研究背景：

系统性红斑狼疮，俗称蝴蝶病，是一种以过量产生多种自身抗体和多器官受累为特征的慢性炎症性自身免疫性疾病。患者体内存在多种自身抗体，抗体与抗原结合形成免疫复合物沉淀在靶组织中，引起一系列炎性介质释放，从而造成器官组织的损伤。

实验设计路线：

差异甲基化位点筛选

实验方法：Infinium Human Methylation 450 BeadChips （Illumina）样本类型：外周血 DNA

样本数量：3 例活动期患者 vs 3例正常对照；

3例稳定期患者 vs 3例正常对照；

显着差异 CpG 位点筛选：|avg. Δβ|>0.1,且 p value < 0.05;活动期患者 vs 健康对照

显着差异 CpG 数量：2099 个基因中 3719 CpG 位点稳定期患者 vs 健康对照

显着差异 CpG 数量：539 个基因中 983 CpG 位点

选择 IFI44L 作为候选标志物的原因：

1. IFI44L 的所有显着差异CpG 位点均位于转录起始位点上游 1500bp 范围和 5』-UTR 区域内；2. IFI44L_cg06872964 检测到的 CpG 位点在活动期患者和稳定期患者外周血 DNA 中甲基化水平都显着低于健康对照。

3. 课题组之前研究结果也曾发现，在红斑狼疮患者的 CD4+细胞和中性粒细胞中 IFI44L 基因启动子都呈现低甲基化状态。

IFI44L 是一种干扰素刺激基因，也就是能被干扰素诱导上调表达的基因。早期研究发现其有一定的抗丙肝病毒活性，最近研究还发现病毒感染会引起人外周血单核细胞 IFI44L 基因表达上调。

接下来，研究人员开始针对 IFI44L 启动子区特殊 CpG 位点，即芯片中 cg06872964 探针覆盖的 2 个 CpG 位点甲基化水平进行了大样本量的焦磷酸测序检测，作为探究该 CpG 位点是否可作为系统性红斑狼疮诊断标志物的依据。

后期验证：共有 4210 个患者和志愿者参与了后期的验证工作。

探索组验证 （验证中国患者对候选标志物的特异性和敏感性）实验方法：焦磷酸测序 （Pyrosequencing）

样本类型：外周血 DNA

样本数量：

377 例红斑狼疮患者 vs 358 例正常对照

353例类风湿性关节炎患者 vs 358 例正常对照

实验结果：

在红斑狼疮患者的外周血单核细胞 DNA 中，Site 1 和 Site 2 这两个 CpG 位点的甲基化水平明显低于健康对照和类风湿性关节炎患者。

验证组 1（验证中国患者对候选标志物的特异性和敏感性）实验方法：焦磷酸测序 （Pyrosequencing）

样本类型：外周血 DNA

样本数量：

529 例红斑狼疮患者 vs 569 例正常对照

429 例类风湿性关节炎患者 vs 569 例正常对照

199 例原发性干燥综合症 vs 569 例正常对照

[验证组 2（验证欧洲患者对候选标志物的特异性和敏感性）

实验方法：焦磷酸测序 （Pyrosequencing）

样本类型：外周血DNA

样本数量：615 例红斑狼疮患者 vs 781 例正常对照

IFI44L 启动子甲基化与临床特征的关系

将 906 例中国红斑狼疮患者，按照临床特征分成 290 例肾损害和 616 例无肾损害两组，结果发现伴有肾损害的患者 IFI44L 启动子甲基化水平明显低于无肾损害的患者。

另外，研究人员还分别对 30 例红斑狼疮患者的症状活动和缓解时期的血液样本 DNA 中 2 个 CpG 位点的甲基化水平作了比较，其中 86.67% （26/30） 和 66.67% （20/30） 的患者在缓解期的甲基化水平要高于活动期。

研究进行到这里，虽然说就已经可以证明 IFI44L 启动子甲基化水平是一种特异性高、敏感性强的系统性红斑狼诊断标志物，但仍不清楚 IFI44L 甲基化水平变化的原因。

因为系统性红斑狼疮患者最显着的一个特征就是外周血单核细胞中受Ⅰ型干扰素调节的基因异常持续过量表达，即所谓「干扰素标记」现象。而且考虑到 IFI44L 本就是一种干扰素刺激基因，所以研究人员首先怀疑是否可能是由于红斑狼疮患者体内Ⅰ型干扰素过量表达才触发红斑狼疮患者 IFI44L 启动子的甲基化水平降低。

为了弄清楚这个疑惑，研究人员采用 Ficoll-Hypaque 密度梯度离心法，分别从系统性红斑狼疮患者和健康对照的 20 ml 外周血中分离得到外周血单核细胞。研究人员将单核细胞置于在 RPMI-1640 培养基中培养， 同时用 1000 U/L 干扰素-α 刺激单核细胞。焦磷酸测序结果显示在单核细胞培养过程中，即便研究人员使用干扰素-α对单核细胞刺激的时间达到 48 小时，但作为诊断标志物的 IFI44L 基因两个 CpG位点在患者和健康对照两组的甲基化水平都没有发生明显变化，也就表明并不是由于系统性红斑狼疮患者体内干扰素-α升高才导致患者 IFI44L 基因的甲基化水平降低。

本文中的 450K 甲基化芯片服务以及焦磷酸测序服务均由上海伯豪生物技术服务有限公司提供。

原文出处：

Zhao M, Zhou Y, Zhu B, Wan M, Jiang T, Tan Q, Liu Y, Jiang J, Luo S, Tan Y, Wu H, Renauer P, Del Mar Ayala Gutiérrez M, Castillo Palma MJ, Ortega Castro R, Fernández-Roldán C, Raya E, Faria R, Carvalho C, Alarcón-Riquelme ME, Xiang Z, Chen J, Li F, Ling G, Zhao H, Liao X, Lin Y, Sawalha AH, Lu Q. IFI44L promoter methylation as a blood biomarker for systemic lupus erythematosus. Ann Rheum Dis. 19 January 2016 [PMID: 26787370 ]