RT-PCR经验浅谈二

很抱歉，这阵子忙了好久，没有时间来写后续的部分。因为第一次写的时候承诺过继续写下去的 http://www.dxy.cn/bbs/post/view?bid=67&id=323830&sty=3 希望没有让等待的战友太失望。

言归正传：

这一次谈一下逆转录酶和逆转录反应的问题，在一般的逆转录反应中，较常用的是MMLV（鼠源的）和AMV（禽源的）两种，现在更有各家公司推出的耐热的（50-60度）、超长片段的逆转录酶，这方面具有专长的数gibco（现在并购于invitrogen）。

我们实验室使用的一般是MMLV，鼠源的酶，虽然活性比较低一点，但是对应的RNaseH活性也很低，在长时间的逆转录过程中，不会造成模板的降解，获得cDNA的几率大，适用于较长的cDNA链的合成。对于从细胞培养物中利用RT-PCR方法扩增mRNA丰度低的基因也很有效。但是AMV也有其自身的优点，酶的活性很高，扩增1kb以下的基因时比较常用，我知道临床上血液检测中有时使用AMV，省时，也省试剂。

另外，MMLV逆转录反应的条件比较好掌握，反应液的组分简单，AMV的反应液有的需要添加焦磷酸钠（这种试剂不好找到）。

反应温度最好每次都控制不变，MMLV我每次都使用37度，虽然mannual上说使用特异性引物可以升到42度进行逆转录反应，但是有一次42度没有扩增结果，改为37度却扩出了所需要的带（使用的20mer特异性引物），从此以后我一直使用37度，后来的结果也还可以。

长片段逆转录，比如某些RNA病毒的全基因组RT-PCR扩增，10kb左右，可以选用上面提到的耐热、RNaseH-的逆转录酶，可能比较贵一点，但是很多文献报到能够得到很好的扩增，本人尝试过，说实话，可能没有太认真去优化条件，很遗憾连设计的6kb都没有得到扩增产物。由此，我建议大家不要轻易尝试这个方法，一则扩增的难度确实存在，另外，扩增的忠实性不能得到很好的保证。不同的实验目的也不一样，一下子得到这样长的片段，后续的改造也很困难。

还有一个需要指出的问题是，有些同行喜欢一下子提很多RNA，加保护剂如RNase inhibiter等，冻存，以后长期使用，我不推荐这样做。RNA在低量存在时非常容易降解，任何保存方法都比不上不保存^_^，我的做法是马上做RT，不吃饭也要做上去，为了省去日后不尽的麻烦，切记切记！

各位，谈谈你的感受吧，抑或自己的亲身经历！（读后感踊跃撰写中.......）