PCR技术及其在临床诊断应用中的进展

PCR技术及其在临床诊断应用中的进展
　　　王保龙

　　聚合酶链反应（Polymerase chain reaction, PCR）技术自1989年开始被应用于临床检验以来，以其快速、简便、灵敏等优点很快地成为临床实验诊断学的一个技术热点。目前，已广泛用于涉及到核酸的科学研究以及临床疾病的诊断和治疗监测。PCR技术虽然作为一种新生的高新技术而代表临床实验诊断学发展的又一里程碑，但十多年的临床实践表明，传统的PCR技术本身还存在着一些问题，如产物污染导致的假阳性、不能准确定量等。为了解决上述问题，使PCR技术更适用于临术检测，经国内外学者的不懈努力，目前众多PCR衍生技术和相关技术已应运而生。本文将就国际上普遍接受的，国内SDA批准的Taqman技术、PCR-ELISA技术的原理和临床应用进展作一简单介绍。
实时荧光定量PCR技术
　　实时荧光定量PCR技术于1996年由美国Applied Biosystems公司推出。与常规PCR相比，它具有特异性更强，有效解决PCR产物污染、自动化程度高，同时能对起始模板进行准确定量等特点。

一、实时荧光定量PCR的原理
1. 荧光定量PCR反应原理
　　实时荧光定量PCR反应是在常规PCR的一对引物之外，加入一个两端带有荧光标记的寡核苷酸探针。在探针完好的状态下，5´端报告荧光基团的激发光被3´端的淬灭荧光基团所抑制。PCR反应过程中，随着链的延伸，Tao酶沿着DNA模板移动到荧光标记探针的结合位置，发挥它的5´→3´外切核酸酶活性，将荧光探针切断，释放出报告荧光基团的荧光信号，每合成一个模板，一个报告基团的信号释放，被释放的激离报告荧光基团的数目和PCR产物是一对一的关系。通过定量PCR仪定时动态监测每一循环，可以得到样品实际扩增曲线，找到PCR扩增的对数期。软件通过标准品的待测品的对数期比较，得到每一样品模板DNA的起始拷贝数。
2. 定量原理
2.1 CT值 表示每个PCR反应管内荧光信号到达设定的域值时所经历的循环数。研究表明，各模板的CT值与该模板的起始拷贝数的对数存在线性关系，起始拷贝数的对数存在线性关系，起始拷贝数越多，CT值越小，反之亦然。利用已知起始拷贝数的标准品可作出标准曲线，其中横坐标代表起始拷贝数的对数，纵坐标代表CT值。因此，只要获得未知样品的CT值，即可从标准曲线上计算出该样品的起始拷贝数。
2.2 荧光域值（threshold）的设备
PCR反应前15个循环的荧光信号作为荧光本底信号，荧光域值是PCR3-15个循环荧光信号标准差的10倍，即threshold=10×Sdcycle6-15。荧光域值设定在PCR扩增的指数期。
2.3 基线（Baseline） 是指在PCR扩增反应的最初数个循环里，荧光信号变化不大，接近一条直线，这样的直线即基线。

二、实时荧光定量PCR的特点
1 特异性 FQ-PCR具有引物和探针的双重特异性，故与传统的PCR相比，特异性大为提高。
2 敏感性 FQ-PCR的敏感度通常达10²拷贝/ml，且线性范围很宽，为0-1011拷贝/ml。一般来讲临床标本中病原体的数目为0-1010/拷贝，在此范围内FQ-PCR定量较为准确，标本不需稀释。
3 重复性 FQ-FCR结果相当稳定，同一标本的CT值相同，但其产物的荧光量却相差甚大。因为域值设置在指数扩增期，在此阶段，各反应组分浓度相对稳定，没有副作用，CT与荧光信号的对数呈线性关系。而当PCR反应进入平台期后，由于反应体系各组分的耗尽，酶活性的降低及产物的反馈抑制等原因导致产物不再增加。与终点法相比CT值能更稳定，更精确地反映起始模板的拷贝数。同时，因PCR是对原始待测核酸模板的一个扩增过程，任何干扰PCR指数扩增的因素如扩增孔间温度差异，标本中DNA聚合酶抑制剂的存在，加样的差异，待测标本中核酸模板的量等，都会影响扩增产物的量，因此，在扩增产物的数量与起始模板数量之间没有一个固定的比例关系，通过检测核酸产物很难对原始模板准确定量。
4 降低产物污染的风险性

三、FQ-PCR作为定量PCR的争议
　　关于FQ-PCR能否作为一种定量PCR技术，目前存在着两种完全对立的学派，一派认为：Taqman技术不使用“内对照系统”只能作为一种定性的测定方法，原因是各反应孔的扩增效率是不同的。另一派认为实时荧光定量PCR无需内标，理由是：（1）CT值的重现性好。由于PCR循环在到达CT值所在的循环数时，刚刚进入真正的指数扩增期，此时微小的误差尚未放大，因此CT值重现性好，即同一模板不同时间扩增或同时间不同管内扩增，得到的CT值是稳定的。（2）由于CT值与起始模板的对数存在线性关系，因此，实时荧光定量PCR是一种采用外标准曲线的定量方法，无需做内对照。（3）内标会对实时荧光定量PCR产生不利影响。若在待测样品中加入已知起始拷贝数的内标，则PCR反应变为双重PCR，双重PCR反应中存在两种模板之间的干扰和竞争，尤其当两种模板的起始拷贝数相差较大时，这种竞争会表现的更为明显。由于待测样品的起始拷贝数是未知的，所以无法加入合适数量的已知模板作为内标。也正是这个原因，传统定量方法虽然加入内标但仍然是一种半定量的方法。

PCR-ELISA 技术

一、原理
PCR引物5´端标记上地高辛或生物素等非放射性标记物，扩增产物滴加到固定有特异性探针的微孔板上，再加入抗地搞辛或生物素酶标抗体一辣根过氧化物酶结合物，最终加底物显色，在酶标板上测定OD值判定结果。常规的PCR-ELISA只能作为一种定性试验，但若加入内标，作出标准曲线也可实现定量检测的目的。
二、PCR-ELISA法的特点
1. 特异性 近似于FQ-PCR，两者均具有引物和探针的双重特异性。
2. 敏感度 较FQ-PCR略高
3. 可加入内标，监测样品PCR受抑制情况，监测PCR平均效率，修正实验数据。
4. PCR-FLISL法产物污染的风险性相对较大。

PCR 技术在临床诊断中的应用
一、病原体的定性及定量检测，PCR及其相关技术适用于病毒，细菌、寄生虫等所有病原体的检测，以下就SDA首批的四种病原体基因诊断项目加以说明。
1. PCR技术在结核菌检测中的应用及意义
结核菌基因诊断的意义主要表现在：a. 区分TB与其它分枝杆菌；b. 检测TB耐药基因；c . 提高TB的阳性检出率。
2. PCR技术在HBV检测中的应用及意义
3. PCR技术在HCV检测中的应用及其意义
HCV是引起输血后肝炎的主要致病因子，因其在血中的含量极低，仅为HBV的1%，其免疫学标志只有抗-HCV一项，且至今病毒分离尚未成功，所以HCV的检测较HBV困难的多，因此，PCR技术在HCV的检测出显得格外重要，其意义主要表现在：
3.1 抗-HCV可作为HCV感染诊断的指标。由于个体间免疫功能的差异，部分患者出现抗-HCV较晚，免疫功能低下者和经免疫抑制治疗者甚至可能不产生抗-HCV；因此HCV-RNA是HCV感染的确诊标志。据报道，在患者发病30-60天和6-30个ELISA抗-HCV的检出率分别为45%和67%，说明ELISA检出抗-HCV有相当高的漏检率。
3.2 在“窗口期”没有抗-HCV产生，但可检测出RNA。
3.3 HCV-RNA定量可指导用药，为疗效观察及预后判断提供客观指标。血清HCV拷贝高对干扰素不敏感，低敏感，据报道，HCV<100pg/ml组：11/30转阴HCV>100pg/ml组：1/30转阴。
HCV-RNA持续维持高水平状态可能预后不佳。
3.4 抗-HCV阳性并不能代表现症感染，丙型肝炎的诊断标准是HCV-RNA(+).
4. PCR在CT检测中的应用
CT是非淋菌性尿道炎的主要病原微生物之一，有时还可引起不育等其它疾病。CT为专性细胞寄生性，一般培养不能生长，只有在活细胞内才能增殖复制，实验室通过Mcloy、Hela-229细胞培养观察包涵体，可认为是诊断“金标法”。但因操作复杂，技术要求高，需时间长，并不适于临床检测。免疫学方法有直接免疫荧光法、EIA法等，但这两种方法无论是检测抗原还是抗体阳性率均不足50%，用单抗会丢失位点、多抗有交叉反应，在高危人群筛查中常与金黄色葡萄球菌、链球菌、淋球菌等发生交叉反应使其特异性受到影响，因此，国内外专家一致认为CT的基因诊断方法应定为“金标准”。
二、PCR及其相关技术在血源筛查中的应用
献血是我国医用血液的最主要来源，根据全国血液中心1999年的统计，我国各主要血站采集的血液样本达到680万份，占2百万病人提供血液进行输血治疗。长期以来，我国血站的血液病毒筛查都是使用免疫学方法，大部分血站是用国产ELISA试剂做两遍测试，检查项目包括：乙肝表面抗原（HBSAg）,丙肝抗体（HCVAb）。由于免疫学方法灵敏度较低（检出下限为108拷贝），重复性较差，同时存在抗原抗体的变异，再加上病毒感染的窗口期，使得该筛选方法存在一定程度的漏检，对输血安全构成了极大的威胁。近年来，因输血导致输血后肝炎的诉讼也不断增加，血液安全再次受到全社会的关注。
为保障输血安全，世界各国不断改进血液筛查技术，核酸检测技术（NAT）由于灵敏度高，特异性强，而且是直接检测病毒本身，受到各国血液筛查工作者的重视。随着核酸检测技术的发展和成熟，尤其是荧光定量PCR方法的应用，NAT逐渐进入血液筛查领域，近年美国红十字会开始将NAT应用于血液筛查，明显提高了HBV，HCV和HIV的检出率。欧洲和也普遍采用NAT作为血液的复筛手段。
我国是肝炎的高流行区，1995年全国肝炎流行病学调查研究结果显示约9.57%的人群为HBSAg携带者，3.2%的人群抗HCV阳性，HIV的感染率迅速 上升。最近的调查数据显示，人群中乙肝携带者已上升到10.12%，丙肝携带者也有近5%，在这样一高流行人群中，征集健康安全的医疗用血是血液事业的重要工作，由于ELISA方法学固有的缺陷，因此核酸检测技术及其标准急待在我国被确立和推广应用。在2001年1-3月间由国家卫生部临检中心组织对全国6个中心城市血站的7800份血液样品进行荧光定量PCR测试，显示出较高的阳性率。而10万例以上的临床统计数据表明，HBV的ELISA漏检率较高，这些漏检的血样，直接威胁到受血者的安全。
三、PCR及其相关技术在肿瘤基因诊断中的应用
随着分子肿瘤学研究的发展，目前已能从基因水平对癌症进行诊断，也能通过检测与癌变有关的基因标志物来判定组织学的良、恶性程度，癌的进展以及肿瘤的耐药性。肿瘤的基因诊断主要是通过检测肿瘤基因标志的变化来实现的；下面主要就常见的肿瘤基因标志物与肿瘤的关系以及PCR技术在肿瘤诊断中的意义加以讨论。
（一）常见的肿瘤基因标志物及其与肿瘤的关系
1. K-ras基因 是位于染色体12p12.1上的编码21kD（p21）蛋白的编码基因。P21的活化在传达细胞外源性增殖信号中具有重要的作用，变异型p21与正常型p21相比其GPT酶活性明显下降，认为与癌变有关。K-ras基因的点突变主要集中在特定的氨基酸密码子（第12，13，61）上，而这种异常以大肠癌、胰腺癌、肺癌等发生率较高，在胰腺癌中，K-fas基因的点突变发生率高达90%，且大部分局限于密码子12上。大量的研究表明，K-ras基因阳性，即使病理组织学诊断淋巴结转移阴性，癌症复发的可能性也很高，因此，K-ras基因点突检测不仅对肿瘤的诊断而且对其预后判断都有一定的价值。
2. p53基因 是一种抑癌基因，是目前人类肿瘤中最常发生变化的基因。它位于染色体17p13.1上，编码53KD的核磷酸蛋白，此蛋白通过p21蛋白参与细胞周期的调控，对细胞的分裂和增殖起负调节作用，若突变，则最终使细胞生长和分化的调节失控，导致细胞的持续分裂和癌变。在许多恶性肿瘤中均发现有p53基因的异常，肺癌为50%-70%，膀胱癌约为60%，胰腺癌为70%-80%,在肝癌和子宫内膜癌中也有较高的发生率。针对大肠肿瘤的研究表明，p53的杂合性丢失（LOH）频度在大肠腺瘤中为20%，而在大肠癌中则为85%-95%，提示p53基因的异常可能与腺瘤的癌变有关。
3. DCC基因 是位于染色体18q21.3上的抑癌基因。肿瘤组织，DCC基因的杂合性丢失和DCC mRNA表达低下在胃癌，大肠癌中呈现较高的频率，特别是在肝转移的病例中，提示它可能作为肝转移的一个诊断标志。
4. 微卫星DNA 在人类基因组中有许多CA、GT等散在的2-4个碱基对的单纯反复排列，称为微卫星。有关它的功能还不明了。据报道，在家族性非息肉性大肠癌中以及散在性大肠癌中有高比率的微卫星反复排列数量的异常。
5. 端粒酶 位于染色体末端的端粒在人体中是由T、T、A、G、G、G6个碱基构成一个单位，在生殖细胞中以长约20kb，体细胞中以6-10kb的长度进行反复排列，通常认为端粒与染色体的稳定性有关，其长度随着细胞的反复分裂而缩短，缩短到一定程度细胞再分裂，也就是说，细胞分裂的寿命取决于端粒的长度。在癌细胞中存在有延长端粒的酶。胃癌、大肠癌、肾癌、前列腺癌等端粒酶表现为高度的活性。除了表达异常外，端粒的微小缺失和易位也与肿瘤的发生有着密切的关系。
6. p16基 p16基因定位于9p21上，全长8.5kb，由2个内含子间隔3个外显子组成，它是细胞周期蛋白依赖性激酶抑制因子，参与细胞周期的调节，与肿瘤的发生有着密切的关系。
P16基因纯合缺失常见于各种肿瘤。不同的肿瘤其纯合缺失的非分率各不上同，以食道癌最高，约92.3%。在急性淋巴细胞性白血病（ALL）中40%存在p16纯合缺失，在T细胞ALL中缺失率高达83%，其他肿瘤p16基因纯合缺失的百分率分别为恶性间皮瘤61.9%，胰腺癌40.5%，卵巢癌22%。
P16基因突变与肿瘤的发生也有着密切的关系。据报道，在肺癌中14/27例存在p16基因突变且都导致编码的氨基酸序列改变，在18个家族性黑色素瘤家系中，13个家系存在着8种p16基因突变型，包括无义突变，错义突变，剪接供体位点突变等。
（二）、肿瘤基因诊断的常用技术
肿瘤基因诊断的常用技术有：荧光原位杂交（FISH）法，主要用于癌基因、抑癌基因突变的检测；PCR及PT-PCR法，用于肿瘤异常基因和异常基因mRNA的扩增：PCR-SSCP法，用于突变检测。突变等位基因扩增法（MASA），它是肿瘤基因突变最敏感的检测方法。
（三）、肿瘤基因诊断的评价
肿瘤的发生、发展是一个复杂的多因子协同的过程，包括启动（最初细胞伤害）、进展（形成肿瘤）及扩散（恶性程度进一步增高）等，在许多情况下，单个癌基因结构、功能变化不足以引起恶变；而2个或多个癌基因间的相互协同作用，是维持某些细胞的恶性类型所不可缺少的。因此，某一肿瘤基因标志物阳性结果只能单纯提肿瘤DNA的存在，并不能代表活的癌细胞的存在。一般情况下肿瘤基因标志物变化的检测只能是一种临床诊断和预后判定的辅助手段，但也有一些癌基因遗传学变化的检测已达到确认某些肿瘤的程度，例如CD44基因的异常拼接表达，几乎100%出现于某些泌尿系肿瘤。慢性骨髓性白血病患者几乎都可检测到原癌基因易位导致的BCR/ABL融合基因形成。
（四）、PCR及其相关技术在遗传性疾病诊断中的应用
遗传性疾病根据其遗传方式可分为单基因遗传病和多基因遗传病。单基因遗传病只受一对主基因的影响而发病。多基因遗传病不是由一对主基因所导致的，而是多对微交基因所产生的协同作用并与环境因素共同导致发病，这些等位基因可存在于正常人群中，但具有越多的此类等位基因，患病的可能性就越大，因此，此类基因称为易感基因。对于某些单基因遗传病，可通过直接法检出患者的缺陷基因而诊断。直接法包括：点突酶切图分析、基因或大片段缺失的NDA酶切图谱分析、PCR结合分子杂交法等。对于大多数人类遗传病来说，目前尚不知其原发基因缺陷所在，也不知其基因产物是什么，因此难以用直接法进行分析，可用遗传连锁分析和关联研究来进行致病基因遗传定位，从而对未明基因缺陷或基因遗传病做出间接诊断。
（五）、FQ-PCR技术在疾病相关蛋白基因表达水平检测中的应用
FQ-PCR技术在疾病相关蛋白mRNA可反映基因的表达水平。因此，临床上检测肿瘤抗原的基因表达水平能对肿瘤做出早期诊断：如CEA、AFG、PSM、HZY等mRNA定量检测显著地提出了肿瘤的检出率。据报道，外周血AFP-mRNA早于AFP蛋白半-1年出现，故检测外周血AFP-mRNA为原发性肝癌的早期治疗争取了时间。此外，肿瘤标志物mRNA水平的高低还与肿瘤的复发、转移、分化程度及大小有关。

　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　摘自：《中国检验医学用品》2002年第2期