【旧贴整理】PCR技术大攻略

丁香园2015-06-29

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一、PCR技术及步骤

 聚合酶链式反应（PCR）
 PCR扩增产物的克隆
 上述两个实验包含基本原理、步骤、问题等。

二、PCR常见问题汇总

1. 没有得到扩增产物 
 
（1）酶失活或在反应体系中未加入酶。Taq DNA聚合酶因保存或运输不当而失活，往往通过更换新酶或用另一来源的酶以获得满意的结果。 
 
（2）模板含有杂质。特别是对甲醛固定及石蜡包埋的组织常含甲酸，造成DNA脱嘌呤而影响PCR的结果。 
 
（3）变性温度是否准确：PCR仪指示温度与实际温度是否相符，过高酶在前几个循环就迅速失活；过低则模板变性不彻底。 

（4）反应系统中污染了蛋白酶及核酸酶，应在未加Taq酶以前，将反应体系95℃加热5-10分钟。 
 
（5）引物变质失效。人工合成的引物是否正确。是否纯化，或因储存条件不当而失活。 

（6）使用PCR试剂盒时还应注意： 
 ①是否严格按照说明书操作； 
 ②试剂使用前是否充分混匀； 
 ③试剂储存过久或不当而失效。 

 
2. 扩增产物在凝胶中涂布或成片状 
 
（1）酶量过高。减少酶量；酶的质量差，调换另一来源的酶。 

（2）dNTP浓度过高。减少dNTP的浓度。 
 
（3）MgCl2浓度过高。可适当降低其用量。 
 
（4）循环次数过多；增加模板量减少循环次数，缩短退火时间及延伸时间，或改用二种温度的PCR循环。
 
（5）退火温度过低。 
 
（6）电泳体系有问题： 
 ①凝胶中缓冲液和电泳缓冲液浓度相差太大； 
 ②凝胶没有凝固好； 
 ③琼脂糖质量差。 
 
（7）若为PCR试剂盒则可能： 
 ①由于运输储存不当引起试剂盒失效； 
 ②试剂盒本身质量有问题，如引物选择、循环参数等选择不当。 
 
（8）降解的陈旧模板扩增也易产生涂布。 

 
3. 溴酚蓝前有区带（很宽） 
 
（1）模板量太低。增加模板DNA的用量。 
 
（2）循环次数太多。减少循环次数。 

（3）复性度偏低。提高复性温度。 
 
（4）预变性后没有立刻上机循环。 
 
（5）引物3'端是否互补；重新设计合成较长的引物。 
 
（6）引物用量偏多。降低引物的使用量。 

 
4. 扩增产物出现多条带 
 
（1）引物用量偏大，引物的特异性不高。应调换引物或降低引物的使用量。 
 
（2）循环的次数过多。适当增加模板的量，减少循环次数。 
 
（3）酶的用量偏高或酶的质量不好，应降低酶量或调换另一来源的酶。 
 
（4）退火温度偏低，退火及延伸时间偏长。应提高退火温度，减少变性与延伸时间，也可采用二种温度的PCR扩增。 
 
（5）样品处理不当。 
 
（6）Mg2+浓度偏高，因适当调整Mg2+使用浓度。 

（7）若为PCR试剂盒，也可能时试剂盒本身质量有问题。