【旧贴整理】PCR技术大攻略

一、PCR技术及步骤

聚合酶链式反应（PCR）
PCR扩增产物的克隆
上述两个实验包含基本原理、步骤、问题等。

二、PCR常见问题汇总

1. 没有得到扩增产物

（1）酶失活或在反应体系中未加入酶。Taq DNA聚合酶因保存或运输不当而失活，往往通过更换新酶或用另一来源的酶以获得满意的结果。

（2）模板含有杂质。特别是对甲醛固定及石蜡包埋的组织常含甲酸，造成DNA脱嘌呤而影响PCR的结果。

（3）变性温度是否准确：PCR仪指示温度与实际温度是否相符，过高酶在前几个循环就迅速失活；过低则模板变性不彻底。

（4）反应系统中污染了蛋白酶及核酸酶，应在未加Taq酶以前，将反应体系95℃加热5-10分钟。

（5）引物变质失效。人工合成的引物是否正确。是否纯化，或因储存条件不当而失活。

（6）使用PCR试剂盒时还应注意：
①是否严格按照说明书操作；
②试剂使用前是否充分混匀；
③试剂储存过久或不当而失效。


2. 扩增产物在凝胶中涂布或成片状

（1）酶量过高。减少酶量；酶的质量差，调换另一来源的酶。

（2）dNTP浓度过高。减少dNTP的浓度。

（3）MgCl2浓度过高。可适当降低其用量。

（4）循环次数过多；增加模板量减少循环次数，缩短退火时间及延伸时间，或改用二种温度的PCR循环。

（5）退火温度过低。

（6）电泳体系有问题：
①凝胶中缓冲液和电泳缓冲液浓度相差太大；
②凝胶没有凝固好；
③琼脂糖质量差。

（7）若为PCR试剂盒则可能：
①由于运输储存不当引起试剂盒失效；
②试剂盒本身质量有问题，如引物选择、循环参数等选择不当。

（8）降解的陈旧模板扩增也易产生涂布。


3. 溴酚蓝前有区带（很宽）

（1）模板量太低。增加模板DNA的用量。

（2）循环次数太多。减少循环次数。

（3）复性度偏低。提高复性温度。

（4）预变性后没有立刻上机循环。

（5）引物3'端是否互补；重新设计合成较长的引物。

（6）引物用量偏多。降低引物的使用量。


4. 扩增产物出现多条带

（1）引物用量偏大，引物的特异性不高。应调换引物或降低引物的使用量。

（2）循环的次数过多。适当增加模板的量，减少循环次数。

（3）酶的用量偏高或酶的质量不好，应降低酶量或调换另一来源的酶。

（4）退火温度偏低，退火及延伸时间偏长。应提高退火温度，减少变性与延伸时间，也可采用二种温度的PCR扩增。

（5）样品处理不当。

（6）Mg2+浓度偏高，因适当调整Mg2+使用浓度。

（7）若为PCR试剂盒，也可能时试剂盒本身质量有问题。