细胞培养最常见注意事项

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1.为什么要热灭活血清?

加热可以灭活补体系统。激活的补体参与溶解细胞事件，刺激平滑肌收缩，细胞和血小板释放组胺，激活淋巴细胞和巨噬细胞。在进行免疫学 研究、培养ES细胞、昆虫细胞和平滑肌细胞时，推荐使用热灭活血清。

2.L-谷氨酰胺在细胞培养 中重要吗?它在溶液中不稳定吗?L-谷氨酰胺在细胞培养时是重要的。脱掉氨基后，L-谷氨酰胺可作为培养细胞的能量来源、参与蛋白质的合成和核酸代谢。L-谷氨酰胺在溶液中经过一段时间后会降解，但是确切的降解率一直没有最终确定。L-谷氨酰胺的降解导致氨的形成，而氨对于一些细胞具有毒性。

3.GlutaMAX-I是什么?培养细胞如何利用GlutaMAX-I?这个二肽有多稳定?GlutaMAX-I二肽是L-谷氨酰胺的衍生物，将其不稳定的α-氨基用L-丙氨酸来保护。一种肽酶逐渐裂解二肽，释放L-谷氨酰胺供利用。

GlutaMAX-I二肽非常稳定，即使在121磅灭菌20分钟，GlutaMAX-I二肽溶液有最小的降解，如果在相同条件下，L-谷氨酰胺几乎完全降解。

4.制备 lipid-DNA的方法会影响转染 效率吗?是的。对于LIPOFECTAMlNE Reagent，稀释试剂在100μl OPTI-MEM中，稀释DNA在100μl OPTI-MEM中。混合两种溶液在室温下孵育15分钟。对于LIPOFECTIN Reagent，在加入DNA溶液前允许稀释的试剂和培养基孵育至少30分钟可以增加3倍的效率。确保复合物在没有血清的情况下形成。孵育15分钟后，在复合物中加入含有血清的培养基(800μl)。(注意以上是35mm培养皿使用体积)。对于LIPOFECTAMlNE Plus Reagent DNA应该在与脂质体混合之前首先与Plus Reagent混合。LIPOFECTAMlNE 2000的操作步骤允许在一个很小的体积下混合DNA和脂质体，接下来可以不需要换培养基的情况下直接加入。

5.我使用SF900 Ⅱ时，细胞生长良好，但是为什么我的蛋白产物不如使用Graces 液和10%胎牛血清时效果好?如果目的蛋白是一个后期蛋白，它将与蛋白酶一起表达，这些蛋白酶将会作用于目的蛋白。在加有血清的培养基中，这些蛋白酶将作用到血清中的蛋白，从而使目的蛋白产品保持完好。在无血清配方中，蛋白酶作用的唯一底物是你的目的蛋白。为了避免这一问题，加入一些蛋白酶抑制剂或加入少量的血清(少于1%)，让血清给蛋白酶提供作用底物。

6.如何检测内毒素(热源)水平?LAL(Limulus Amebocyte Lysate)试验是可用的最敏感和特异的检测细菌 内毒素的方法。Levin和Bang 发现细菌可引起鲎(Limulus polyphemus)血管内的凝集作用。内毒素启动一个细胞内酶原系统(丝氨酸蛋白酶级联反应系统)，通过修饰凝集素，产生一种透明的胶，LAL中的凝固蛋白，从而，形成不可溶的基质。LAL试剂缓冲的鲎(血细胞)裂解物。

胎牛血清的内毒素检测是在Grand Island，按照手册上Gel-clot 方法进行的。在对血清产品进行内毒素检测前，用无热源的水1：10稀释样品。稀释样品沸水育5分钟，以消除抑制剂。(通常，血液中的内毒素结合成份的出现会抑制凝胶过程，使内毒素不能与LAL反应。样品预先热处理可以消除这种抑制作用。)

7.我可以使用固体形式的Murashige Skog 培养基吗?

如果使用固体形式的培养基，需要加入琼脂 。琼脂加入前要先灭菌。应该避免MS培养基的直接灭菌，应该高压灭菌琼脂溶液，然后把融化的琼脂溶液加入到MS培养基中。

8. 20℃下配制的缓冲液，在较高或较低的温度下PH值会改变吗?

对于普通使用的缓冲液，PH值随温度变化而变化。

例如 20℃下配制PH7.4 Tris缓冲液,40℃时PH值为 7.4-(2x0.310)=6.78

9. 室温下(25℃)配制的Tris-HCl溶液，在37℃使用时PH值是多少?

缓冲液的PH值随温度变化而变化。下表列出了50mM Tris-HC 溶液在4℃，25℃，37℃时，不同的PH值。

10. 昆虫细胞培养的最适PH值和渗透压是多少?

生长培养基的PH值对细胞的增值和病毒或重组蛋白的生产均会产生影响。对于大部分鳞翅类昆虫细胞系，在PH值 6.0-6.4范围的大部分应用效果良好。培养鳞翅类昆虫细胞系时，培养基的最适渗透压是 345-380mOsm/kg.。为保证可靠和持久的细胞培养方式，减少技术问题，保持PH值和渗透压在以上所列的范围之内。

11. High Five细胞有任何其它名称吗?

High Five细胞也被称为Trichoplasia ni 5B1-4和BTI-TN-5B1-4。

12.在High Five无血清培养基中去污剂的浓度是多少?

High Five无血清培养基中去污剂的浓度：0.025 g/L Tween-80，1.0 g/L Pluronic Poly-all。

13.High Five细胞用多大的密度冻存?

3.0x10E6 cells/ml