细胞培养转染Wnt配体的生产和纯化

[精华提要]Wnt配体蛋白在体外含量丰富，但是纯化非常困难。该方法使用Wnt11r蛋白作为一个例子来说明如何使用293T细胞产生分泌Wnt11r和收集Wnt11r蛋白质，在体外作进一步的生化实验。
材料与试剂


1. 293T细胞

2. 胎牛血清（Invitrogen公司，10438-026）

3. DMEM（高糖 货号＃11965，Invitrogen公司）

4. PEN /链球菌（Sigma公司P4333）

5. EDTA的胰蛋白酶（Invitrogen公司15050-065）

6. PBS缓冲液（Invitrogen公司14040-182）

7. Effectene转染试剂（QIAGEN 301425）

8. 抗FLAG M2（Sigma公司A2220）

9. 0.1M的甘氨酸 - 盐酸PH3.5

10. 0.5 M的Tris - HCl



设备

1. 离心机

2. 水浴

3. 50毫升锥形管

4. 100毫米的培养皿

步骤

1. 分离293T细胞：

1) 在室温下，温的介质（DMEM培养液+10％胎牛血清的1％的PEN /链球菌）和PBS缓冲液在37°C水浴和0.05％胰蛋白酶EDTA。获得50毫升的锥形管，和一个100毫米的培养皿来传递细胞。

2) 吸去旧介质。添加10毫升PBS缓冲液冲洗细胞。轻轻摇动培养皿。吸出Hass缓冲液。

3) 添加1毫升0.05％胰蛋白酶EDTA至100毫米培养皿与293T细胞融合。在37°C为1分。轻轻摇动培养皿。您会看到细胞脱离培养皿。加入9毫升介质和轻轻用吸管向上和向下吹打以让细胞从板上脱离。分离后，倒入50 ml锥形管。

4) 在1000 RPM离心细胞为3-4分钟。用真空的巴斯德吸管取出上清液。添加10毫升培养基和轻轻用吸管向上和向下吹打重新悬浮细胞。

5) 加入9毫升的新鲜介质和1毫升的悬浮细胞到新培养皿。这个培养皿将使用到第5天。你也可以做一个1:5和1:20稀释，在第三天和第7天细胞将分别汇合。

6) 细胞生长在37℃，5％CO2培养箱中。3天后检查介质，如果介质变成淡黄色，更改介质。

2. 接种细胞和转染：

7) 将细胞像steps1-6中在100毫米培养皿稀释为1:10的比例。生长16-24小时。这些细胞将成为30-40％联合。

8) 温暖的介质和Hass缓冲液放在37°C。在盖中混合DNA（Wnt11r表达一个FALG的标志）。按照自Qiagen转染步骤：

a. 在300μl EC缓冲液混合8微克的DNA。

b. 添加64μl增强剂，拌匀吹打。在盖下孵育5分钟。

c. 加60μl effectene拌匀，孵育10分钟。

d. 加3000μl介质到混合液中。

注：上述的量是在一个100毫米的培养皿转染。

e. 在潜伏期，从细胞中移除旧介质，并在10毫升PBS缓冲液冲洗一次。

f. 在细胞中加7毫升的新鲜介质。当孵化结束后，添加混合液到培养皿（共3424 μl: 300 μl+64 μl+60 μl+3000 μl）。轻轻摇动培养皿。

g. 在37/CO2孵化器细胞。

9) 第2天：从培养皿中取出转染介质。添加另外10毫升的新鲜介质（沿着边缘慢慢吸管介质。细胞逐出除了通过吸管介质）。生长3-4天。

注意：这一步完全是可选的。细胞在effectene转染介质中生长得很好。

3. 收集Wnt11r-FLAG上清液：

10) 经过4天在15毫升锥形管中的生长。在1000RPM旋转5分钟。通过硝酸纤维素膜（0.2微米）过滤。根据文献记载，Wnt信号配体可以储存于4°C几个月，不会损失活性。但是不知道wnt11r是否也是。可选：分装上清液1毫升，在-80°C存储。

11) 用抗FLAG珠拉下wnt11r标志蛋白。

a. 彻底悬浮样品瓶中的抗FLAG M2凝胶。悬浮液和凝胶的比例是2:1。 （即如果你想获得20μl的珠，就用宽头移液管从小瓶取出40μl）。按照制造商的说明清洁抗FLAG珠。

b. 用冷TBS缓冲液洗净珠（40μl凝胶悬液500μl）4遍。在5000 – 8000g离心珠子30秒的。处理样品前等待1-2分钟。用吸管尖取出上清液。要小心，不转移任何珠。

c. 用0.1 M甘氨酸 - 盐酸PH3.5清洗珠，以减少未结合的抗体。

d. 注意：不要把珠放在甘氨酸盐酸时间超过20分钟。

e. 再次用TBS缓冲液清洗珠共3次。

f. 增加wnt11r介质到珠中。管放在轮上4 °C = O / N

可选：将它们添加到珠之前您可以添加蛋白酶抑制剂到介质中。

注：上述每一个步骤应该是在冰上或在4 °C。

12) 使用甘氨酸 - 盐酸缓冲洗脱wnt11r-FLAG蛋白。

a. 离心珠子，并用吸管尖取出介质。

b. TBS缓冲液洗磁珠3次。请确保所有上清都弃去了。

c. 用0.1M的甘氨酸 - 盐酸洗脱wnt11r-FLAG蛋白质。

d. 增加100ul 0.1M甘氨酸- HCl缓冲液到珠中。孵育的样品在室温下轻轻摇动5 分钟。

e. 5000-8000g离心30秒。

f. 将上清转移至含有10μl 0.5 M的Tris - HCl，PH7.4，1.5M NaCl的新鲜管。要小心，不转移任何珠。

g. 上清液在4 °C储存可立即使用。长期储存在-20 °C存储。

13) 确定洗脱缓冲液中蛋白质的量。

a. 以10μl洗脱蛋白质，添加10μl 2XSDS的样品缓冲液。煮沸5分钟，然后运行SDS - PAGE凝胶。对于标记物，将不同量的牛血清白蛋白在每个道跑。用G -蓝色染色凝胶，然后确定在10μl洗脱液中的蛋白质的数量。

b. wnt11r-FLAG的大小是44KD。


配制溶液

1. 介质

DMEM培养液

10％FBS

1％Pen /链球菌


References

1. Jing L., Lefebvre J.L., Gordon L.R., Granato M. (2009). Wnt signals organize synaptic prepattern and axon guidance through the zebrafish unplugged/MuSK receptor. Neuron 61(5): 721-33.
(责任编辑：大汉昆仑王)