细胞培养实验

一、制备1000mlRPMI 1640培养基；
RPMI 1640 干粉培养基10.4g（1包）
蒸馏水 400ml
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磁力搅拌至完全溶解
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加三蒸馏水定容至1000ml
在超净台内无菌条件下，用灭菌后的并置有0.22μm孔径滤膜的过滤器除菌，并分装成200ml/瓶，-20℃保存备用。用前取一瓶溶解，每200ml培养液加灭活的小牛血清至终浓度为10%，即加22ml。再加青霉素和链霉素至终浓度各为100U/ml。
小牛血清灭活方法：将-20℃冻存的小牛血清取出溶解后，置56℃水浴30分钟即可。
　
二、操作方法
1、准备：每次操作前用30W紫外线管灯消毒超净台20～30分钟；肥皂水洗手，0.2%新洁尔灭或70%酒精擦手。在开始操作前打开空气过滤装置，点燃酒精灯（以后一切操作均在近火焰处进行）。
2、换液和传代：通常细胞置于自控CO2温箱培养，箱内稳定供应5% CO2 ，如营养成分已耗尽，则需更换培养液。一般情况下，当细胞生长铺满瓶壁需进行传代，其方法如下：①弃掉旧培养液，加入0.25%胰酶消化液，消化2～5分钟（每一细胞株有其指定的消化液和消化时间，必要时显微镜下观察掌握）。②吸出或到掉消化液，加适量培养液用吸管轻轻吹打使细胞悬浮。③取少许计数，将细胞悬液接种新培养瓶中传代培养。
　
三、细胞冻存
【用品】
对数生长期细胞（证明无支原体污染）
0.25%胰蛋白酶 10.0ml
BSS 50.0ml
培养液 20.0ml
DMSO（优质无色；或优质无色甘油） 若干
吸管 5支
离心管 4支
塑料或玻璃安瓿（2ml） 5支
喷灯或酒精灯 1支
标记小牌和线绳 若干
纱布小口袋（三层） 5个