间接免疫印迹检测的方法

【准备工作】

在准备做抗原检测时，须考虑所用一抗和二抗的最佳浓度，对不同来源的抗体，其特异性抗体的浓度都不相同。因此，对一抗体进行滴定有助于确定最佳反应比例，预先滴定二抗对实验也有帮助，一旦确定最佳浓度，则每次印迹即可用同一批一抗、二抗来完成。多数情况下可采用商家提供的浓度进行检测。

【材料与试剂】

（1） PBS：称取8g NaCl；0.2g KCl；1.44g Na2 HPO4 和0.24g KH2 PO4 ，加蒸馏水800ml，用HCl调节溶液pH值至7.4，加水至1L，在1.034?105 Pa高压下蒸气灭菌20min,室温保存。

（2） 封闭液（见表3-3）。

（3） 1%BSA/PBS

（4） 一抗试剂和碱性磷酸酶或辣根过氧化物酶标记的二抗试剂（通常是用辣根过氧化物酶标记的抗免疫球蛋白抗体）。

（5） 碱性磷酸酶底物溶液：

① NBT（氮蓝四唑）溶液：在10ml 70%的二甲基甲酰胺中溶解0.5g NTB；

② BCIP（5-溴-4-氮-3-吲哚磷酸）溶液：在10ml 70%的二甲基甲酰胺中溶解0.5g BCIP；

③ 碱性磷酸酶缓冲液：100mmol/L NaCl；5mmol/L MgCl2 ；100mmol/L Tris-HCl (pH9.5)，置密闭容器中保存，此溶液稳定；

④ 取66μl NBT溶液与10ml碱性磷酸酶缓冲液混匀，加入33lμlBCIP溶液。

（6） 辣根过氧化物酶底物溶液：用9ml的0.01mol/L Tris-Cl (pH 7.6)溶液中溶解6mg3-3′―二氨基联苯胺，加入1ml 0.3%(w/v)NiCl2 或CoCl2 ，用Whatman1号滤纸过滤以除去沉淀，加入10μl 30%H2 O2 混匀后立即使用。此溶液须在临用时配制。

【操作方法】

（1） 用PBS漂洗印迹膜数次；

（2） 加入一种封闭液（见表3-3）。注意：不同的抗原和实验方法需用不同的封闭缓冲液。例如，BSA（V部分）和牛奶都含有磷酸化的酪氨酸和生物素，用特异性抗磷酸化酪氨酸抗体进行实验时，这会给解释实验结果造成一定的混淆，也给亲合素/链霉亲合素检测的应用带来一些问题。某些牛奶制品可抑制碱性磷酸酶的活性。若无信号或检测背景较高，则需尝试不同的封闭缓冲液；

（3） 室温下搅动孵育。一般孵育20min~2h或4℃过夜较好；

（4） 从封闭缓冲液中取出印迹膜，用PBS漂洗3次，每次5min；

（5） 加入工作浓度的一抗溶液。每张15×15cm的印迹膜用量为10ml。所有的稀释液均用含有蛋白质的溶液，例如1%BSA/PBS。孵育可在浅盘或塑料袋中进行。在室温下将抗体和印迹膜搅动孵育至少1h。有人认为4℃孵育过夜（12~18h）可提高灵敏度；

（6） 用PBS漂洗印迹膜4次，每次换液洗5min；

（7） 此时，印迹膜便可加入工作浓度的标记的二抗溶液。可在浅盘或塑料袋中室温孵育1h。抗体用含有蛋白质的溶液进行稀释，例如1%BSA/PBS。商品化的酶标二抗应在5~0.5μg/ml浓度之间使用（通常将商品试剂原液稀释成1:200～1:2000的应用液）。用辣根过氧化物酶标记的试剂须用不含叠氮钠的封闭液稀释；

（8） 用PBS漂洗印迹膜4次，每次换液洗5min；

（9） 将经漂洗的印迹膜移至另一干净浅盘中，按印迹膜面积加入0.1ml/cm2 的底物溶液（若使用碱性磷酸酶标记的二抗，用碱性磷酸酶底物溶液，若用辣根过氧化物酶标记的二抗则用辣根过氧化物酶底物溶液），于室温轻轻摇动，待蛋白条带的颜色深度达到要求（约2~20min），用水略为漂洗，放入PBS中；

（10） 拍摄照片，留作永久实验记录（过氧化物酶染色的蛋白条带经日光照射数小时后颜色将退去）。