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免疫组化(Elivison二步法)

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<font>(1)石蜡切片置于67℃烘箱中,烘片2小时,脱蜡至水,用pH7.4的PBS冲洗三次,每次3分钟(3×3’)。<br /> (2)取一定量pH=6.0柠檬酸盐缓冲液,加入微波盒中,微波加热至沸腾,将脱蜡水化后的组织切片置于耐高温塑料切片架上,放入已沸腾的缓冲液中,中档微波处理10分钟,取出微波盒流水自然泠却,从缓冲液中取出玻片,先用蒸馏水冲洗两次,之后用PBS冲洗2×3’。(<font>注:不是所有的抗体都需要微波修复的,视具体情况而定</font> )<br /> (3)每张切片加1滴3% H2O2,室温下孵育10分钟,以阻断内源性过氧化物酶的活性。PBS冲洗3×3’。<br /> (4)除去PBS液,每张切片加1滴相应的第一抗体(相应稀释倍数),室温下孵育2小时。<br /> (5)PBS冲洗3×5’。除去PBS液,每张切片加1滴聚合物增强剂(试剂A),室温下孵育20分钟。PBS冲洗3×3’。<br /> (6)除去PBS液,每张切片加1滴酶标抗鼠/兔聚合物(试剂B),室温下孵育30分钟。PBS冲洗3×5’<br /> (7)除去PBS液,每张切片加1滴新鲜配制的DAB液,显微镜下观察5分钟。<br /> (8)苏木素复染,0.1%HCl分化,自来水冲洗,蓝化,切片经梯度酒精脱水干燥,二甲苯透明,中性树胶封固,晾干后观察。<br /> 注:即用型第二代免疫组化Elivision plus广谱试剂盒,购自福州脉新生物技术开发有限公司。包括:生物素化抗兔二抗、亲和素(Reagent A)、生物素-辣根过氧化物酶(Reagent B)、二氨基联苯胺(DAB)</font>

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