免疫组化实验过程中的要点和技巧

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1.固定： 最好用4%的多聚甲醛固定液。对于冰冻切片，甲醛固定有时比冰冻丙酮好;但对于不同的组织和抗原 ，可选用不同的固定液。 有时候商品化的抗体会有比较适合而推荐的固定液，请于购置前注意说明书。

Bouin S固定液：饱和苦味酸750ml，甲醛250ml，冰醋酸50ml，其对组织的穿透力较强，固定较好，结构完整，但因偏酸，对抗原有一定损害，且组织收缩明显，不适于组织标本的长期保存。

PLP液：即高碘酸钠-赖氨酸-多聚甲醛，适于固定石蜡切片。适于富含糖类组织，对超微结构及许多抗原的抗原性保存较好。

2.组织脱水，透明 ：时间不能太长，否则在切片时容易碎片，切不完整。

3.切片时展片： 有些组织在切片后难以在水中展开，这时可适当地在水中加入几滴乙醇。

4.烤片： 60℃ 30分钟或37℃ 过夜，温度太高或时间太长，抗原容易丢失。

5.蜡块及切片的保存 ：最好在4℃保存

6.脱片问题： Poly-L-Lysine(多聚赖氨酸)为目前免疫组化 染色工作中最常用的一种防脱片剂，6ml的多聚赖氨酸溶液可按1:10稀释成60ml的工作液，适合于需要酶消化、微波、高温高压的防脱片处理。如不行，可用双重处理(APES和Poly-L-Lysine)的切片。在以上两种条件都行不通的情况下，可用如下方法：切片在脱蜡前，放在APES 1：50 丙酮溶液中浸泡3分钟，晾干，即可进行下一步。

7.灭活内源性酶 ：HRP系统：3%双氧水灭活;AP系统：3%HAc灭活。

8.暴露抗原： 对于石蜡切片的免疫组化实验 时，必须采用高温加热抗原修复，这将有助于暴露抗原决定簇，从而增加免疫组化染色的强度(不同抗体的最佳修复液请参阅抗体说明书)。对于不同的组织，不同的抗原，不同的抗体，所采用的方法应不一样，可进行热修复、胰酶消化、既不修复也不消化。胶原还可以用胃蛋白酶消化等。

9.封闭： 在山羊血清封闭，非特异性染色仍然较强时，可延长封闭时间或用浓缩血清封闭

10.抗体稀释 ：应遵循“现用现配”的原则，对于PBS稀释的抗体一定要当天使用。

11.背景高： 在抗体浓度、反应时间、反应温度等合适的条件下，如果背景依旧高，可采用含1‰ Tween20的PBS洗，特别是在显色之前要多洗。

12.返蓝： 在苏木素复染后，可用碱性缓冲液(如PBS)或Na2HPO4的饱和溶液返蓝。

13.显色： 一定要在显微镜下观察，注意控制背景。

14.在整个操作过程中，切片千万不能干燥，否则会有非特异性染色。