免疫组化技术常见问题解答攻略

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1、石蜡切片和冰冻切片的比较?

(1)要求做冰冻切片的不一定能做石蜡切片，这是今天我向一老师请教得出的结论。因为作石蜡切片时要高温烤片，可能会破坏组织的抗原 性，如果组织的抗原性较稳定，则可作石蜡切片;但是要求做石蜡切片的，可作冰冻切片。

(2)冰冻切片的优点是能够较好的保存组织的抗原 免疫活性，做免疫组化时不需抗原修复这一步。缺点是细胞内易形成冰晶而破坏细胞结构，可能会使抗原弥散;切片厚度较石蜡的厚，做的片子没石蜡的漂亮。当你买一抗时，目录上都写着做什么样的切片，如果它写着只能做冰冻，就不能做石蜡，如写着两者都可，那就都能做。

(3)石蜡切片的优点可以保持组织细胞的形态结构，且容易存放在室温，而冰冻切片比较麻烦，一定要存在-80度的低温冰箱中，尤其是用来做原位杂交 的的切片，为了防止RNA降解，保存一贯很重要。由于石蜡切片可以切到4微米左右，所以原位杂交探针容易渗透到组织中去，容易成功，而且得到的颜色/形态都较冰冻切片好。

2、一抗的选择要点和技巧 是什么?

(1)单克隆和多克隆抗体的选择。由一种克隆产生的特异性抗体叫做单克隆抗体。单克隆抗体能目标明确地与单一的特异抗原 决定簇结合，就像导弹精确地命中目标一样。另一方面，即使是同一个抗原决定簇，在机体内也可以由好几种克隆来产生抗体，形成好几种单克隆抗体混杂物，称为多克隆抗体。在抗原抗体反应中，一般单克隆抗体特异性强，但亲和力相对小，检测抗原灵敏度相对就低;而多克隆抗体特异性稍弱，但抗体的亲和力强，灵敏度高，但易出现非特异性染色(可以通过封闭等避免)。

(2)应用范围的选择。有的一抗只能用于Western blotting，或免疫组化、免疫荧光、免疫沉淀等;甚至表明石蜡切片或冰冻切片。

(3)种属反应性的选择(species reactivity)。这一点很重要，表明这种抗体可能存在种属差异，且这种抗体适合检测哪种种属动物体内的抗原。

(4)种属来源，一般兔来源的多是多克隆;而小鼠来源的多是单克隆，但也有另外。根据此来源来选择相应的二抗。

(5)生产厂家的选择。如santa Cruz公司抗体一般1ml，价格2100元左右;而chemicon公司一抗一般100ul，价格2800元左右。这两个厂家的同一种抗体它的实际效价稳定是不同的，我一般用后者抗体做免疫组化效果较好，而前者做Western blotting效果还可以。

3、在什么情况下使用Triton-X100

(1)Triton X-100化学名称为聚乙二醇辛基苯基醚，是一种去污剂。在免疫组织化学(>10um厚切片) 和免疫细胞化学中一般用Triton X-100 作为细胞通透剂，在膜上打孔。

(2)其作用原理：Triton X-100 可以溶解细胞膜、细胞核膜、细胞器膜上的脂质而使抗体及大分子结构的物质进入胞浆和胞核内，故在细胞免疫组化时尤为推荐使用，这样抗体就能顺利进入胞内与相应抗原结合。

(3)Triton X-100既是一种表面活性剂，也有抗氧化作用。

4、封闭血清的选择原则是什么?

(1)膜上或切片上有剩余的位点可以非特异性吸附抗体，造成后续结果的假阳性!

(2)封闭血清一般是和二抗同一来源的，血清中动物自身的抗体，预先能和组织中有交叉反应的位点发生结合，否则在后面的步骤中如果和二抗发生结合，会造成背景。

(3)也可以用小牛血清、BSA、羊血清等，但不能与一抗来源一致。

5、抗体孵育条件的比较?

(1)一抗孵育温度有几种：4度、室温、37度，其中4度效果最佳;孵育时间：这与温度、抗体浓度有关，一般37度1-2h，而4度过夜和从冰箱拿出后37度复温45min。

(2)二抗一般室温或37度30min-1h，具体时间需要摸索。

6、一抗4度孵育后为什么要进行37度复温?

(1)一方面，防止切片从4度直接放入PBS易脱片;

(2)另一方面，使抗原抗体结合更稳定。一般不需要，但对表达较弱的抗原可能有用，4度和37度时分子运动方式不同，前者分子碰撞机率和运动速度小于后者，后者结合更快，但敏感性也提高了并易造成非特异染色。

(3)其实，我更赞同后一种说法，因为我尝试把肝脏或睾丸片子从4度过夜拿出后，直接用PBS洗没发生过脱片现象。事实胜于雄辩!

7、DAB显色时间如何把握?

(1)DAB显色时间不是固定的，主要由显微镜下控制显色时间，到出现浅棕色本底时即可冲洗;

(2)DAB显色时间很短(如几秒或几十秒)就出现很深的棕褐色，这很可能说明你的抗体浓度过高或抗体孵育时间过长，需要下调抗体浓度或缩短你的抗体孵育时间;

(3)此外，若很短时间就出现背景很深，还有可能你前面的封闭非特异性蛋白不全，需要延长封闭时间;

(4)DAB显色时间很长(如超过十几分钟)才出现阳性染色，一方面可能说明你的抗体浓度过低或孵育时间过短(最好一抗4度过夜);另一方面就是封闭时间过长。

8、免疫组化结果如何分析?

(1)阳性着色细胞计数法。在4undefined光镜下，随机选择不重叠的10个视野，人工或机器计数阳性着色细胞，每组3~6张不同动物组织切片，然后进行组间比较即可。

(2)灰密度分析法。通过在不同组别和不同动物组织切片上选择相同区域、相同条件下用image j进行灰密度分析，然后进行统计分析即可。

(3)评分法。通过在光学显微镜下对组织切片分别按染色程度(0~3分为阴性着色、淡黄色、浅褐色、深褐色)、阳性范围进行评分(1~4分为0~25%、26~50%、51~75%、76~100%)，最终可以分数相加，再进行比较。

对于以上这几种方法，各有利弊，请细心选择。要想得到正确结果的前提是你要做出着色均匀、背景很浅的高质量切片。

9、在什么情况下进行组织抗原修复，抗原修复的条件是什么?

(1)由于组织中部分抗原在甲醛或多聚甲醛固定过程中，发生了蛋白之间交联及醛基的封闭作用，从而失去抗原性。通过抗原修复，使得细胞内抗原决定族重新暴露，提高抗原检测率。

(2)修复方法从强到弱一般分为三种，高压修复、微波修复、胰酶修复。修复液也分为若干种(具体的可以查阅相关资料，大量的：中性的、高pH的等)。

(3)微波修复，我们一般用6miundefined4次，效果不错。