抗原修复(Antigen retrieval ，AR)技术及其在免疫组化中的应用
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福尔马林固定时，组织中的许多氨基酸残基在分子内或分子间形成了醛键，使得不少抗原决定簇被封 闭。同时，由于甲醛的聚合作用，使蛋白质分子间相互交联形成大分子网络，也导致了抗原决定簇被掩盖， 这就使得相当部分的抗原不能与抗体很好是进行反应。因此，抗原修复也是影响免疫组化染色结果的基本 因素。抗原修复(Antigen retrieval ，AR)技术，建立在 Fraenkel-conrat 等人[1]一系列生物化学研究，经 1991 年 shi 等人[2]发展。抗原修复是指石蜡、冰冻、火棉胶、塑料切片免疫组织化学（IHC）前用胰蛋白 酶、尿素、表面活性剂、微波缓冲液和金属盐等，使被掩盖的抗原决定簇或变性的抗原重新暴露或抗原性 得到一定程度的恢复过程。抗原修复能最大程度地恢复在制片等过程中损失的抗原性，使原来认为不能在 石蜡切片上进行 IHC 的许多抗体获得了良好的染色结果，成为一种有效的补救措施。本文的目的是概述 AR-HIC 的发展、应用和标准化。
一、AR技术
加热AR技术
微波加热方法. 在传统标准方法,经脱蜡、脱水和用 3%H2O2 阻断内源性过氧(化)物酶，石蜡切片经蒸 馏水冲洗，放置在塑料 Coplin 缸中。加入 AR 液，如蒸馏水、缓冲液、金属盐液、尿素等，盖上并置家用 微波炉加热 5 或 10 分钟（注意防止切片干躁）。有时在加热 5 分钟后，间隔 1 分钟，再加热 5 分钟（在第 一个 5 分钟后检测液体高度）。加热后，从微波炉取出塑料 Coplin 缸，冷却 15 分钟。片子经蒸馏水冲洗二 次后在 PBS 液中浸 5 分钟，才进行 IHC 染色。为了保持一致的加热条件，必须设定靠近微波炉中心相同 的位置及同一编号的 Coplin 缸 ，按照不同的抗体设定不同的加热时间，尽可能的建立标准的加热条件。 微波（MW）加热过程如下：在专用盒内放入 200ml 柠檬酸缓冲液（PH6.0±0.1），并盖上带有小孔的 盖子，微波加热至沸腾；将脱蜡水化后的组织切片置于耐高温塑料切片架中，放入已沸腾缓冲液中，有作 者提供做免疫组化时采用微波炉中等功率 800W[3]，微波炉选用解冻档的国产家用微波炉(根据目前的研究, 建议用医用微波炉)，中档继续处理 10-20 分钟；取出微波塑料缸冷却至室温，从缓冲液中取出玻片，片子 经蒸馏水冲洗二次，之后用 PBS（PH7.2-7.4）冲洗两次，每次 3 分钟。
尽管有少数作者[4]认为经高温后冷却这一步省略。在我们观点，15 分钟的冷却必须的几点理由：1、如这 一步省略，对于有些抗体而言，会降低 AR-IHC 染色强度。2、突然从高温到低温可导致组织片掉片。3、 可能引起形态学的变化。
单纯加热方法 将切片放入盛有柠檬酸缓冲液的容器中,置电炉（600W）上加热至沸腾，并持续 10min 。 Shi 等人[2]用单纯加热方法与微波加热方法比较 IHC 染色强度，显示两种方法导致相同的染色强度。 高压加热方法. Shin 等人[5]发展了含水高压锅煮沸方法，来增强福尔马林固定的脑组织 tau 蛋白免疫反 应性。将切片连同柠檬酸缓冲液放入高压锅内，加热至产生喷气，并持续 2min，压力锅离开热源，加热长 短的控制很重要，从组织切片放入缓冲液到高压锅到压力锅离开热源总时间在 5-8 分钟，时间过长可能会 使染色背景加深。现 试剂 公司提供的大多数抗体都建议使用高压锅煮沸方法，这几年的实践表明，采取此 方法可避免假阳、阴性，使 IHC 染色效果更佳。
非加热AR技术
非加热 AR 技术包括酶消化、酸水解等方法。目前，主要是酶消化，酶消化是以化学的方法来打断醛键， 修复抗原。
胰蛋白酶消化法.取 0.05g 或 0.1g 胰蛋白酶加入 100ml0.05％或 0.1％PH7.8 的无水氯化钙水溶液中， 溶解即可；或由迈新提供的 0.125%的液体胰酶。将切片放入湿盒内 37oC 温箱中消化 18-20 分钟。 胃蛋白酶消化法 . 用 0.1mol/L HCL 配制成 0.4％的胃蛋白酶； 链霉蛋白酶消化法 . 将链霉蛋白酶溶于0.5mol/LpH7.4的Tris-HCL中，浓度为o.1％，消化时间20min。
抗原修复的方法选择，关系到组织抗原能否暴露充分，这对免疫组化染色效果有很大影响。因此应当 根据不同的抗原特点，采用不同的修复方法。对某些细胞内抗原（如 Fas、Bax、FⅧ等）和细胞间质抗原 （如 Laminin、CoIV 等）则需要用酶消化法处理切片。常用的消化酶为胰蛋白酶和胃蛋白酶。一般说来， 胰蛋白酶消化能力较胃蛋白酶弱，主要用于细胞内抗原的消化，胃蛋白酶主要用于细胞间抗原的消化。工 作中要认真参照抗体说明书指示进行消化酶的选择，这样针对性更强，标记效果更理想。
总之,以高压加热方法、微波加热方法较为稳定, 高压加热方法效果优于微波加热方法和单纯加热方法。 溶液的浓度对修复效果无任何影响，而 PH 值则影响较大。缓冲液以柠檬酸缓冲液和 Tris-HCL 较常用。前 人的研究表明，温度高修复时间短[6]。解放军第 251 医院根据临床病理诊断、鉴别诊断和研究的实际需要， 在抗原修复方法规范研究和应用的基础上，创用了胰蛋白酶—尿素联合消化技术、盐酸水解暴露抗原技术 和 MW—表面活性剂 Triton X—100（MW—TX）修复抗原技术 [7] 。抗原暴露或抗原修复方法较多，其中 发 MW—枸橼酸缓冲液使用较多，效果最好。MW 修复抗原的方法是石蜡切片脱蜡、水洗后放入修复液中， 用 250W 的输出功率 2X5min，待冷却至室温按常规处理。目前 AR 过程已成功应用在 BioTek 全自动免疫 组化染色仪中。
一、AR技术
加热AR技术
微波加热方法. 在传统标准方法,经脱蜡、脱水和用 3%H2O2 阻断内源性过氧(化)物酶，石蜡切片经蒸 馏水冲洗，放置在塑料 Coplin 缸中。加入 AR 液，如蒸馏水、缓冲液、金属盐液、尿素等，盖上并置家用 微波炉加热 5 或 10 分钟（注意防止切片干躁）。有时在加热 5 分钟后，间隔 1 分钟，再加热 5 分钟（在第 一个 5 分钟后检测液体高度）。加热后，从微波炉取出塑料 Coplin 缸，冷却 15 分钟。片子经蒸馏水冲洗二 次后在 PBS 液中浸 5 分钟，才进行 IHC 染色。为了保持一致的加热条件，必须设定靠近微波炉中心相同 的位置及同一编号的 Coplin 缸 ，按照不同的抗体设定不同的加热时间，尽可能的建立标准的加热条件。 微波（MW）加热过程如下：在专用盒内放入 200ml 柠檬酸缓冲液（PH6.0±0.1），并盖上带有小孔的 盖子，微波加热至沸腾；将脱蜡水化后的组织切片置于耐高温塑料切片架中，放入已沸腾缓冲液中，有作 者提供做免疫组化时采用微波炉中等功率 800W[3]，微波炉选用解冻档的国产家用微波炉(根据目前的研究, 建议用医用微波炉)，中档继续处理 10-20 分钟；取出微波塑料缸冷却至室温，从缓冲液中取出玻片，片子 经蒸馏水冲洗二次，之后用 PBS（PH7.2-7.4）冲洗两次，每次 3 分钟。
尽管有少数作者[4]认为经高温后冷却这一步省略。在我们观点，15 分钟的冷却必须的几点理由：1、如这 一步省略，对于有些抗体而言，会降低 AR-IHC 染色强度。2、突然从高温到低温可导致组织片掉片。3、 可能引起形态学的变化。
单纯加热方法 将切片放入盛有柠檬酸缓冲液的容器中,置电炉（600W）上加热至沸腾，并持续 10min 。 Shi 等人[2]用单纯加热方法与微波加热方法比较 IHC 染色强度，显示两种方法导致相同的染色强度。 高压加热方法. Shin 等人[5]发展了含水高压锅煮沸方法，来增强福尔马林固定的脑组织 tau 蛋白免疫反 应性。将切片连同柠檬酸缓冲液放入高压锅内，加热至产生喷气，并持续 2min，压力锅离开热源，加热长 短的控制很重要，从组织切片放入缓冲液到高压锅到压力锅离开热源总时间在 5-8 分钟，时间过长可能会 使染色背景加深。现 试剂 公司提供的大多数抗体都建议使用高压锅煮沸方法，这几年的实践表明，采取此 方法可避免假阳、阴性，使 IHC 染色效果更佳。
非加热AR技术
非加热 AR 技术包括酶消化、酸水解等方法。目前，主要是酶消化，酶消化是以化学的方法来打断醛键， 修复抗原。
胰蛋白酶消化法.取 0.05g 或 0.1g 胰蛋白酶加入 100ml0.05％或 0.1％PH7.8 的无水氯化钙水溶液中， 溶解即可；或由迈新提供的 0.125%的液体胰酶。将切片放入湿盒内 37oC 温箱中消化 18-20 分钟。 胃蛋白酶消化法 . 用 0.1mol/L HCL 配制成 0.4％的胃蛋白酶； 链霉蛋白酶消化法 . 将链霉蛋白酶溶于0.5mol/LpH7.4的Tris-HCL中，浓度为o.1％，消化时间20min。
抗原修复的方法选择，关系到组织抗原能否暴露充分，这对免疫组化染色效果有很大影响。因此应当 根据不同的抗原特点，采用不同的修复方法。对某些细胞内抗原（如 Fas、Bax、FⅧ等）和细胞间质抗原 （如 Laminin、CoIV 等）则需要用酶消化法处理切片。常用的消化酶为胰蛋白酶和胃蛋白酶。一般说来， 胰蛋白酶消化能力较胃蛋白酶弱，主要用于细胞内抗原的消化，胃蛋白酶主要用于细胞间抗原的消化。工 作中要认真参照抗体说明书指示进行消化酶的选择，这样针对性更强，标记效果更理想。
总之,以高压加热方法、微波加热方法较为稳定, 高压加热方法效果优于微波加热方法和单纯加热方法。 溶液的浓度对修复效果无任何影响，而 PH 值则影响较大。缓冲液以柠檬酸缓冲液和 Tris-HCL 较常用。前 人的研究表明，温度高修复时间短[6]。解放军第 251 医院根据临床病理诊断、鉴别诊断和研究的实际需要， 在抗原修复方法规范研究和应用的基础上，创用了胰蛋白酶—尿素联合消化技术、盐酸水解暴露抗原技术 和 MW—表面活性剂 Triton X—100（MW—TX）修复抗原技术 [7] 。抗原暴露或抗原修复方法较多，其中 发 MW—枸橼酸缓冲液使用较多，效果最好。MW 修复抗原的方法是石蜡切片脱蜡、水洗后放入修复液中， 用 250W 的输出功率 2X5min，待冷却至室温按常规处理。目前 AR 过程已成功应用在 BioTek 全自动免疫 组化染色仪中。
