抗原修复技术

去 污 剂 和 离 液 序 列 高 的 物 质

去污剂可在水溶液中形成微粒，能降低水表面张力，所以也是一种表面活性剂。去污剂模拟脂质双分子层环境，可以溶解膜蛋白，形成由脂质、去污剂及含蛋白质的去污剂微团组成的混合微粒 (通常一个微粒包含一个蛋白质分子）。免疫组化方法中较为常用的去污剂是非离子型，这些物质适合于打断脂质-脂质、脂质-蛋白质间的相互作用而不破坏蛋白质-蛋白质相互作用；因此不是变性剂。非离子化去污剂主要包括 TritonR-X 100 、 Tween
2 0 、皂 苷 、B R U R 、NP-40; 它们通常加入漂洗缓冲液中（如 0. 0 5 % V / V Tween 20 ) 。

折散剂包括盐酸胍、硫氰酸钠、铯 等 ，被认为是蛋白质变性剂，通过打开蛋白质复合体而部分打开或逆转福尔马林导致的蛋白质交联。通常使用去污剂或拆散剂的抗原修复法比 酶 抗 原 修 复 法 和 热 抗 原 修 复 法（H IE R ) 效 率 低 ，一 般 与 酶 或 加 热 联 合 使 用 。

一、酶抗原修复法

在 热 诱 导 抗 原 修 复 法 出 现 之 前 ，蛋 白 酶 诱 导 的 表 位 修 复（ Protease-induced epitope retriev a l,P IE R ) 是 最 为 常 用 的 方 法 。许 多 酶 都 曾 被 应 用 于 这 一 技 术 中 ，其 中 最 常 用 的 是 胰蛋 白 酶（ tryp sin ) 、蛋 白 酶 K 、链 霉 蛋 白 酶（prom ise) 、无 花 果 蛋 白 酶（ficin ) 及 胃 蛋 白 酶(pepsin) ™ 。蛋 白 酶 诱 导 的 表 位 修 复 作 用 机 制 很 可 能 是 通 过 酶 消 化 打 断 福 尔 马 林 固 定 过程 产 生 的 蛋 白 质 交 联 ，但 这 种 断 裂 是 非 特 异 性 的 ，对 某 些 抗 原 具 有 负 性 影 响 。蛋 白 酶 诱 导的 表 位 修 复 效 果 取 决 于 酶 的 浓 度 和 种 类 、孵 育 参 数（ 时 间 、温 度 、p H ) 以 及 样 本 被 固 定 的 时间 。酶 消 化 时 间 与 样 本 被 固 定 的 时 间 呈 负 相 关 。 我 们 以 及 其 他 一 些 实 验 室 通 常 对 少 数 酶的 诱 导 表 位 修 复 条 件 进 行 优 化 而 不 是 对 很 多 种 酶 进 行 尝 试 。我 们 使 用 的 是 一 种 市 售 的 立即 可 用 的 蛋 白 酶 K 溶 液 ，在 室 温 下 具 有 很 好 的 活 性 ，可 用 于 自 动 化 免 疫 染 色 装 置 。 蛋 白酶 诱 导 的 表 位 修 复 方 法 的 缺 点 ：不 是 大 多 数 抗 原 的 最 适 修 复 方 法 ; 可 能 导 致 组 织 形 态 学 的改 变 ；可 能 破 坏 抗 原 表 位 。 以 下 将 介 绍 三 种 酶 消 化 法 。

三、 胰蛋白酶（参见试剂准备）

(1) 将 玻 片 浸 入 〇. 1 % 胰 蛋 白 酶 溶 液 (p H 7. 8 ) ，37°C 孵 育 1 0 〜 30m in 。

(2) 用 自 来 水 彻 底 漂 洗 。

(3) 随 后 的 步 骤 为 免 疫 组 织 化 学 染 色 方 法 。

不 同 公 司 、不 同 批 次 生 产 的 胰 蛋 白 酶 溶 液 活 性 不 同 ，会 影 响 抗 原 修 复 的 结 果 。

四、 蛋白酶

(1) 在 组 织 切 片 上 滴 加 0. 0 5 % 〜 0. 5 % ( w /V ) 温 热 的 蛋 白 酶 X X I V ， 37°C 孵育 10 〜 25m in 。

(2) 用 自 来 水 彻 底 漂 洗 。

(3) 随 后 的 步 骤 为 免 疫 组 织 化 学 染 色 方 法 。

五、胃蛋白酶

(1) 将 玻 片 浸 人 〇. 4 % ( ™ / V ) 胃 蛋 白 酶 溶 液 。

(2) 37°C 孵 育 10〜 25m in 。

(3) 用 自 来 水 彻 底 漂 洗 。

(4) 随 后 的 步 骤 为 免 疫 组 织 化 学 染 色 方 法 。

六、 热 诱 导 抗 原 决 定 簇 修 复（H IER)

接 下 来 要 介 绍 的 这 一 组 抗 原 修 复 方 法 彻 底 改 变 了 在 交 联 固 定 剂 中（如 甲 醛 ）固 定 的 抗原 的 免 疫 组 织 化 学 检 测 。 热 诱 导 抗 原 决 定 簇 修 复 是 基 于 Fraenklen-C o n r a t 和 他 们 的 合作 者 提 出 的 一 个 概 念 [9]，他 们 证 实 蛋 白 质 和 福 尔 马 林 之 间 的 化 学 反 应 通 过 高 温 加 热 或 强的 加 碱 水 解 至 少 可 部 分 逆 转 [3]。 目 前 其 机 制 尚 不 清 楚 ，但 它 的 最 终 效 应 是 恢 复 抗 原 在 固
定 过 程 中 的 构 象 改 变 。加 热 可 能 水 解 了 亚 甲 基 交 联 键 而 使 抗 原 表 位 暴 露 ，但 也 可 能 有 其他尚未知的机理，因为加热可以使乙醇固定的组织的免疫染色增强，而乙醇固定是不引起蛋白质交联的。其他的一些机理假设还包括对弥散性封闭蛋白的萃取、蛋白质沉淀、组织切片的再水化以使抗体渗透性更好、加热使切片中微量的石蜡熔解等。固定过程中组织内的钙离子对抗原的掩盖可能起了很大作用。抗原复性时钙螯合剂（如 E D T A ) 有时比柠檬酸盐缓冲液更有效。其实，用不同加热方法（如微波、高压锅、热蒸汽、水浴等) 处理福尔马林固定、石蜡包埋组织切片可逆转甲醛固定对于组织免疫组化染色的有害影响。用较高的温度（l 〇〇°C ) 加热较短时间（IOmin) 的效果要优于相对低温加热较长时间。但 是 ，我们发现对于大多数需要热诱导抗原决定簇修复的抗原通过蒸汽发生器 （90〜95°C ) 孵育20m in 可得到满意的结果。 目前还没有一种通用的抗原修复溶液，目前在使用的有几种不同的热诱导抗原决定簇修复溶液,, 是由不同的缓冲液（如柠檬酸盐、T r is 等）配制成不同 PH (3〜10) 的溶液，其中溶液的 p H 十分重要。一些抗原可在低 p H 溶液中被修复，而另外一些可在高 p H 溶液中被修复, 还有一些可在较宽的 p H 范围内被修复 [1°]。对大部分抗原来说，与 使 用 p H 较高的溶液或者含 E D T A 的溶液相比，使 用 lOmmol/L 柠檬酸钠缓冲液 (p H 6. 0) 可得到更满意的结果和更好的细胞形态。

固定的程度可显著影响抗原对抗原修复的反应。未 固 定 的 蛋 白 质 在 70〜90°C 的温度条件下可发生变性，但经甲醛固定后在该温度下将不会变性。因此使用不同抗原修复
方法检测新抗体的染色效果时要十分注意。使用热诱导抗原决定簇修复法，尤其是使用 p H 较低的溶液时，要考虑到出现非预期的免疫染色的可能。如果条件许可，我们推荐用新鲜冷冻切片和常规石蜡组织切片做免疫反应性的对比实验。

七、 微波炉热诱导抗原决定簇修复

(1) 选择带转盘的微波炉，计时器，设置功率，取两个塑料量杯，分 别 放 入 5 〇〇 ml 缓冲液（浸泡玻片用）和 200m l 水 ，750W 加 热 2m in ，取出量杯。

(2) 将脱蜡玻片完全浸入热的缓冲液中，轻轻盖上杯盖。

(3) 750W 加 热 5m in(需要将溶液烧沸）。

(4) 观察缓冲液的液面，并且添加热水将溶液量恢复到初始水平。

(5) 在整个所需要的时间内 （15〜20 min) 重复步骤 （3)、（4)。

(6) 将容器从微波炉中取出，放入冷自来水中 15min 。

(7) 用蒸馏水清洗玻片，继续免疫染色的步骤.

八、注意

如果选择这种方法进行抗原修复，需要注意一点：由于微波炉内温度变化，可能导致染色结果不一致。

高压锅法热诱导抗原决定簇修复

九、试剂和仪器

Decloaker(Biocare M edical,DC2002)

组织切片容器 (T e k 公司） 或塑料玻片染色缸（Coplin 公司）

H IE R 缓冲液

蒸馏水

方法

(1) 电热锅接上电源，放人托盘。

(2) 向咼压锅内放入 500m l 去离子水，打开拨动开关。

(3) 将 需 热 修 复 的 玻 片 放 人 盛 有 250m l 修 复 缓 冲 液 的 T issu e T e k 容 器 中 ，也 可 选 择盛 有 50m l 修 复 缓 冲 液 的 塑 料 C o p lin 染 缸 。

(4) 将盛有玻片的容器放人高压锅的中央。

(5) 将热防护层放入高压锅的中央。

(6) 将监 护 器 Steam S trip 放在染色皿上，盖上盖子并拧紧。

(7) 盖上蒸汽喷嘴。

(8) 检查所显示的各个参数。
(9) 用 S P l 功能设置加热时间，根据不同抗原所需可设置在 3 〇 s〜5m in 。

(10) 按 D is p la y 键 调 到 S P l ，并按开始键。

(11) 当计时器响起时，按开始/停止键。

(12) 当温度达到 90 °C 时 ，计时器会再一次响起。

(13) 按开始/停止键结束程序，压力读数为〇。

(14) 打开盖子，将玻片冷却几分钟。

(15) 移开玻片容器盖子，用自来水缓慢冲洗玻片。

(16) 将玻片浸入漂洗缓冲液。

注意

(1) 玻片脱赌并再水化后，要一直防止玻片完全干燥。
( 2 ) 由于电热锅中的水很热，所以处理玻片时一定要小心。

蒸汽发生器法热诱导抗原决定簇复原

(1) 将蒸汽发生器底部灌满水。

(2) 将 盛 有 250m l 修复缓冲液的 T issu e T e k 容器放人蒸汽发生器的篮子中。也可选择盛有 50m l 修复缓冲液的塑料 CopUn 染缸。

(3) 打开蒸汽发生器，预 热 Tissue T e k 容 器 或 塑 料 C o p lin 染缸中的抗原修复缓冲液 。通过蒸汽发生器盖子上的小孔放人一支温度计至缓冲液中，将缓冲液加热到 95°C 。

(4) 当温度上升到 9 5 °C 时 ，迅速将组织切片放入缓冲液中（避免手碰到溶液），将缓冲液温度重新加热到 95°C 。

(5) 当温度上升到 9 5 °C 后继续蒸汽 20m in , 或者根据修复抗原的不同选择蒸不同的时间。

(6) 将盛有玻片的量杯移出，室温冷却 20m in。

(7) 流水冲洗 lO m in 。

(8) 将玻片放入漂洗缓冲液中，后续步骤同免疫组化染色的步骤