由补体介导的细胞毒试验(Complement Mediated Cytotoxicity Test)

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补体介导的细胞毒试验(Complement Mediated Cytotoxicity Test)是指特异性抗体与细胞膜上相应抗原 结合后,在补体的参与下,可产生细胞膜损伤,细胞死亡;不带相应抗原的细胞仍然存活.利用染料排斥实验判定淋巴细胞死活状态,活细胞不着色,具有折光性,大小也正常.死细胞着色,体积增大。

一、实验原理

带有特异抗原的靶细胞(如正常细胞、肿瘤细胞、病毒感染细胞)与相应抗体结合后，在补体的参与下，引起靶细胞膜 损伤，导致细胞膜的通透性增加、细胞死亡。染料(例如：伊红-Y、台盼蓝)可通过细胞膜进入细胞内使细胞着色，故可用于指示死细胞或濒死细胞，而活细胞不着色。此即补体依赖性细胞毒试验，利用细胞毒试验可以检查细胞膜抗原，亦可鉴定抗体的特异性。

本实验中，Thy-1 抗原是小鼠胸腺T 细胞特异的表面抗原，在体外利用抗小鼠Thy-1 的单克隆 抗体通过补体的协同作用，可杀伤95%以上的胸腺细胞。

二、实验材料

1. 解剖器械(眼科剪、眼科镊)、平皿、80～100 目不锈钢网

2. 试管、lml 吸量管、尖吸管

3. 载玻片、盖玻片

4. C57BL/6J 小鼠

5. 含5%NBS 的冷Hank's 液

6. 抗小鼠Thy-1 的单克隆抗体(最适稀释度)

7. 补体(豚鼠新鲜血清并经小鼠胸腺细胞吸收，预先测定效价并稀释为最佳稀释度)

8. 1%伊红-Y 染液

三、实验方法

1. 小鼠胸腺细胞悬液的制备：

将4～6 周龄小鼠采用颈椎脱臼法处死，取出胸腺放入已加入约4ml冷Hank's液的平皿中，在100 目的不锈钢网上研磨后，过筛，放入试管，离心1000rpm，5 分钟，用Hank’s液洗两次。将沉淀的细胞重悬于Hank's液中，配成1×107/ml细胞悬液。

2. 取试管3 支，标明顺序，依据下表依次加入1×107/ml胸腺细胞悬液、抗小鼠Thy-1 的单克隆抗体(最适稀释度)及Hank's液，放入37℃水浴30 分钟。

3. 取出后每管加入1%伊红-Y 染液1 滴，混匀，室温放置2 分钟。

4. 重新混匀后分别在一张载玻片上滴片，加盖玻片镜检。先在低倍镜下观察，再用高倍镜观察，比较3 管中细胞死活情况。

四、实验结果

死细胞呈红色，无光泽且肿胀变大;活细胞不着色、有光泽且形态正常。高倍镜下计数200 个细胞并计算其中死细胞的百分数。计算公式如下：

五、注意事项

(1)胸腺细胞制备速度要快，且需在冰浴中进行操作，以保持细胞活力。

(2)抗Thy-1 的单克隆抗体和补体的效价要在预实验中确定。

(3)细胞对照管死细胞数若超过5%，实验需重新做。

(4)细胞滴加到载玻片上后长时间放置不检测也可导致假阳性反应。