实验35 蛙类在体心肌细胞动作电位的测定

实验35 蛙类在体心肌细胞动作电位的测定

　　【目的要求】

　　1．学习用玻璃电极技术测定蟾蜍在体心肌细胞动作电位的方法。

　　2．观察心肌细胞动作电位的波形及其与心电图的对应关系。

　　【基本原理】

　　在静息情况下，心室肌纤维表面的任何两点都是等电位的，但由于细胞膜对不同离子有不同的通透性，造成膜内、外具有明显的电位差：膜外电位为正；膜内电位为负。这种外正内负的状态称为膜的极化状态。当冲动由心脏的起搏点——静脉窦启动，经特殊传导系统而到心室时，心室肌细胞发生兴奋。兴奋部位的心肌细胞膜的通透性发生一系列变化，使膜外电位逐渐降低，由正变负；而膜内电位逐渐增高，由负变正。经过去极化、反极化和复极化等过程，又恢复静息情况下的极化状态。这一系列可扩布性的电位变化即为动作电位。用尖端纤细的玻璃微电极插入心肌细胞，即可将这些电位变化引导出来，经放大后，显示于示波器上。

　　【动物与器材】

　　蟾蜍、常用手术器械、微电极放大器、示波器、微电极操纵器、示波照像机、心电图机、微电极拉制器、玻璃毛细管（直径约2mm）、漂浮电极、无关电极、屏蔽室或屏蔽箱、蛙板、蛙腿夹、3mol/LKCl溶液。

　　【方法与步骤】

　　1．玻璃微电极的制备将自动充灌型玻璃毛细管（内含数条玻璃微丝）置于微电极拉制器上，旋紧两端的固定螺丝，接通电源，调节加热电阻丝的温度及下端的拉力，以便拉出符合需要的微电极（详细方法见第一章第三节“玻璃微电极”）。本实验要求微电极尖端直径在0.5μm以下，其阻抗约为20MΩ。

　　微电极的充灌：用5ml注射器，以尖端较细的塑料管由电极茎部插至肩部，将3mol/LKCl溶液缓缓注入微电极内。注意：微电极内不得有气泡残存。

　　2．漂浮电极的制备在体玻璃微电极技术靠漂浮电极的弹性与心脏的搏动同步，使微电极的尖端稳定在一个心肌细胞内。漂浮电极用直径约为20—30μm的银丝制备。取长约8cm的银丝，绕成直径约为5mm的弹簧圈，圈数约为3—5。弹簧上端焊接于直径1mm、长约3cm的银丝上以便夹持于微电操纵器上。弹簧下端焊接直径约100μm、长约3cm的银丝，以便插入微电极内。按常规方法将弹簧下端的银丝乏极化（详细方法见第一章第三节“刺激电极”）。取合格的玻璃微电极，将其长约1—1.5cm的尖端部分自肩部与锥部之间折断（注意：切勿伤及端部），再将弹簧下端的乏极化的银丝插入微电极内，直至推不动为止，此即漂浮玻璃微电极。对电极需要整形，使玻璃电极与浮漂电极保持垂直，这样对微电极在细胞内的维持时间十分重要。最后用细玻璃棒尖端醮少量石蜡油，使其沿乏极化电极流下，以防微电极内的水分蒸发。

　　3．开胸手术取蟾蜍一只，双毁髓，或氨基甲酸乙酯皮下淋巴囊注射（剂量：2g/kg体重）进行麻醉。其后用蛙腿夹背位固定于蛙板上。按实验19方法暴露心脏。

　　4．心电图导联的连接以针形电极插入前肢和后肢上部皮下，按常规方式连接心电图导联线（详见实验31）。

　　5．电生理仪的连接

　　(1)将跟随器的输出端与微电极放大器的输入端连接（图4-36），放大器的“增益”置于“1”档。

　　(2)将微电极放大器的输出端与示波器“输入选择”的上线连接。示波器上线“灵敏度”为20mV/cm，“扫描速度”为1—0.2ms/cm。再把监听器输出端接至示波器的音响接线柱上。

　　(3)将心电图机的输出端与示波器“输入选择”的下线连接，其“灵敏度”为0.2V/cm。心电图机的灵敏度为1mV=10mm。“记录开关”置于“观察”档，此时示波器下线将显示心电图波形。

　　(4)将漂浮玻璃微电极固定于微电极操纵器上，并将漂浮电极的上端与跟随器的输入端连接。后者的无关电极与靠近心脏的胸肌连接。

　　6．动作电位的观察与记录调节微电极操纵三向坐标粗调，使微电极尖端对准心室表面活动较为平稳的部位。注意：漂浮微电极需垂直待插部位的心脏表面。再用垂直粗调使微电极慢慢下移，并借助于心脏跳动的弹力将微电极尖端刺入心肌细胞内，此时示波器上线即出现动作电位的波形（图4-37），与此同时，监听器的音响也随之发生周期性变化。如动作电位的振幅偏低或波形不佳，可用微电极操纵器提起微电极，改变插入部位再行刺入，直至获得较为理想的波形。

　　待动作电位稳定后，细心观察动作电位的波形，辩认其去极化、反极化和复极化过程。区分动作电位的5个相期，特别注意平台期的形态和持续时间。观察动作电位与心电图的相应关系，特别注意0相期与R波、3相期与T波的对应关系。最后根据示波器灵敏度与扫描速度，测量0相期振幅与动作电位的间期。测量完毕，用示波照像机B门拍照记录。