细菌的接合作用

实验四十七 细菌的接合作用

　　一、目的要求

　　1．了解细菌接合作用的基本原理。

　　2．学习细菌接合实验的基本方法。

　　二、基本原理

　　细菌的接合是指供体菌与受体菌的完整细胞经直接接触时，供体菌的 DNA分子（包括质粒）传递给受体菌而产生基因重组的现象。营养缺陷型菌株例如Me^- Th 或Me Th^- 不能在基本培养基中生长，如果将两者混合培养，使其接合而发生基因重组产生了Me Th 菌株，就能在基本培养基上生长，如图Ⅺ-4。根据这一原理培养，很易检出亿万个细菌中出现的重组细菌。

　　Me=Methionine，甲硫氨酸； Th=Threonine，苏氨酸。

　　三、器材

　　供体菌 E．coliA：Me Th^- ，

　　受体菌 E．coliB：Me^- Th ；

　　完全培养基[胰蛋白胨酵母浸膏葡萄糖培养基（TYEG培养基）]，基本培养基（MM培养基），无菌平皿7套，无菌试管1支，盛9ml无菌水的试管5支，1ml无菌吸管6支。

　　四、操作步骤

　　1．菌悬液制备

　　将E．coliA和E．coliB分别接种于TYEG培养液中，37℃温室中培养24小时。取出培养物3 000r/min离心10分钟，再用无菌生理盐水洗涤离心2—3次，分别制成每毫升中约含菌1×10⁸ 个的菌悬液。

　　2．倒平板

　　将TYEG培养基和MM培养基分别溶化，冷至45℃时倒平板。TYEG培养基2个，MM培养基5个，凝固待用。

　　3．E．coliA和E．coliB稀释，涂布接种作对照

　　用2支1ml的无菌吸管分别吸取1mlE．coliA和1mlE．coliB菌悬液至盛有9ml无菌水并标有“10^-1 A”和“10^-1 B”的试管中，摇匀。然后用无菌吸管以无菌操作取“10^-1 A”试管中的菌悬液各 0．1ml分别加至标有“ TYEGA”和“MMA”平板上，再用另一吸管取“10^-1 B”试管中的菌悬液各0．1ml分别加至“TYEGB”和“MMB”琼脂平板上，分别用无菌涂棒涂匀。将以上四平板倒置于30℃温室中培养2—5天，观察结果。

　　4． E．coliA和E．coliB混合稀释涂平板（细菌的接合作用）

　　(a)E．coliA和E．coliB的混合用2支1ml的无菌吸管分别吸取1mlE．coliA和E．coliB菌悬液至标有“A B”试管中混合，并轻轻摇动混匀。置30℃温室中培养30分钟。

　　(b)E．coliA和E．coliB混合液稀释将培养30分钟的混合菌液用1ml无菌吸管吸取1ml至盛有9 ml无菌水并标有“A B 10^-1 ”的试管中，摇动使其充分混匀。再用另一支1ml无菌吸管吸取1ml“A B10^-1 ”稀释液至第二支盛有9ml无菌水并标有“ A B 10^-2 ”的试管中，以此类推，稀释至“A B10^-3 ”。

　　(c)涂平板用1ml无菌吸管分别吸劝A B10^-1 ”、“A B10^-2 ”、“A B10^-3 ”各0．1ml至标有“MM10^-1 A B”、“ MM10^-2 A B”、“MM10^-3 A B”的基本培养基上。再用3支无菌玻璃涂棒分别将平板表面菌液涂布均匀。倒置于30℃温室中培养2—5天，观察结果。

　　E．coliA和E．coliB接合作用操作如图Ⅺ-5所示。

　　五、实验报告

　　1．结果

　　(1)将E．coliA培养物和E．coliB培养物在两种平板上的生长情况记录于下表中。“ ”表示生长；“-”表示不生长。

　　(2)计算重组子数数不同稀释度的混合菌液在MM平板上长出的菌落数，并计算每毫升未稀释混合菌液中的重组子菌落数，将所得结果填入下表。

　　2．思考题

　　(1)结合课堂所学知识，在这个接合实验中，你如何确定涉及到染色体或F质粒的转移？

　　(2)E．coliA与E．coliB分别划线接种在TYEG培养基和MM培养基琼脂平板上，经培养后，在哪一种平板上生长并形成菌落，你如何解释这个结果？