实验28 真核生物钙调素的酶联免疫测定法

实验28 真核生物钙调素的酶联免疫测定法

原理

　　本法是一种测定抗体的竞争性固相酶联免疫测定法(enzyme linked immunosorbent assay,ELISA)。先将抗原──CaM与固相载体（聚苯乙烯微量滴定板）结合，然后将经待检CaM（标准样品或检样）部分中和的兔抗CaM抗体加入微量滴定板孔中，抑制固相CaM和抗体的反应。接着，废弃上清液，洗涤固相表面，加入辣根过氧化物酶标记的葡萄球菌A蛋白(PPA)与结合在固相CaM上的抗体反应。最后除去多余的未反应的PPA，测定固相结合物的酶活性。酶活性和待检CaM含量呈负函数关系，即固相CaM结合的抗体与PPA量的吸光度值（或B%）随待检CaM含量增加而减小。以一系列已知浓度的CaM对吸光度作图，获得标准竞争抑制曲线。对于未知样品，只要在同样条件下测定反应后的吸光度值，就可以从标准曲线上查得CaM量。测定过程如图5所示。

　　CaM ELISA药盒适用于所有真核生物钙调素(calmodulin,CaM)含量的定量分析，具有灵敏、专一、微样、简便、快速、准确，可对大批试样进行同步测定等优点，广泛适用于生理、生化、细胞生物学、分子生物学、免疫学、药理学和临床检验等许多领域。

仪器药品

　　酶联免疫测读仪 　　　　　　　　　　　　旋涡混合器

　　电炉　　　　　　　　　　　　　　　　　 恒温培养箱

　　超声波粉碎机 　　　　　　　　　　　　　高速离心机

　　匀浆器 　　　　　　　　　　　　　　　　微量加液器

　　小试管　　　　　　　　　　　　　　　　 有盖搪瓷盆（湿盒）

　　移液管 　　　　　　　　　　　　　　　　试管架

　　烧杯

　　CaM ELISA药盒（南京农业大学产品）：

　　1．洗涤缓冲液（washing buffer,WB，干粉），1瓶。用蒸馏水溶解WB干粉并定容到2000ml[含0.01mol/L磷酸缓冲溶液(phosphate buffer saline,PBS)，pH7.4]，临用时加吐温—20至0.05%。4℃保存备用。

　　2．稀释缓冲液（dilution buffer，DB，干粉）1瓶。先用少量蒸馏水溶解DB干粉再定容到300ml[含0.15%牛血清白蛋白(bovine serum albumin,BSA)和0.01mol/L PBS,pH7.4]。使用前加吐温—20至0.05%。—20℃保存备用。

　　3．包被缓冲液（coating buffer，CB，干粉），1瓶。瓶内CB干粉先加少量蒸馏水溶解并定容到50ml（含0.25mol/L硼酸缓冲液，pH9.0）。4℃保存备用。

　　4．基质缓冲液（matrix buffer，MB，液体），1瓶。MB液用蒸馏水稀释至200ml（含0.05mol/L磷酸盐椖仕峄撼逡海琠pH5.0），梍20℃贮存备用（否则极易长菌变质）。5

　　5．CaM包被液（calmodulin coating solution，CCS，干粉），1瓶。瓶内CCS干粉先用少许CB溶解并定容至30ml，即为每ml10μg浓度的CaM包被液。—20℃贮存备用。

　　6．CaM标准液（calmodulin standard solution，CSS，干粉），1瓶。准确吸取4mlDB液加入瓶内，待CSS全部溶解后即为每ml50μg浓度的CaM标准液。—20℃贮存备用。

　　7．兔抗CaM抗体（rabbit anti梍CaM antibody，RACaMAb，干粉），1瓶。用DB液溶解兔抗CaM抗体干粉，并定容到25ml，分装6小瓶，置梍20℃贮存备用。8

　　8．酶标葡萄球菌A蛋白（horseradish peroxidase—linked staphylococcal protein A，PPA，干粉），1瓶。用DB液溶解PPA干粉并定容到30ml，分装6小瓶，置—20℃贮存备用。

　　9．正常兔血清（normal rabbit serum，NRS，干粉），1瓶。瓶内干粉用1ml DB液溶解，置梍20℃备用。

　　10．邻苯二胺（ortho—phenylene diamine，OPD，干粉），1瓶。称取10mg OPD溶于25ml MB液中，临用前加入30%H2_O 2₂₅ μ1即为OPD基质液。此液必须现用现配，贮放暗处，若发现溶液已变色则不能使用。

　　11．硫酸(sulfuric acid 18mol/L)，1瓶。使用时用蒸馏水1∶8，稀释至18ml，即为2mol/L硫酸终止液。

　　12．吐温梍20，1瓶。

　　13．过氧化氢(hydrogen peroxide 30%H2_O 2)，1瓶。

　　14．聚苯乙烯微量滴定板（沪产40孔板），6块。用自来水和蒸馏水将板冲洗3遍，晾干后备用。

操作步骤

　　1．真核生物组织或细胞CaM提取液的制备

　　准确称取真核生物组织1─2g，加入2倍体积(V∶W=2∶1)的冰冷匀浆缓冲液（自备。其成分为：10mmol/L咪唑—HCl,1mmol/L EGTA,1mmol/Lβ─巯基乙醇,10mmol/L MgCl₂ ，0.15mol/L NaCl，pH7.5），用匀浆器快速匀浆，充分提取3─5分钟，再用超声破碎机处理1分钟。倾出匀浆液置试管中，马上浸入90─100℃的水浴中约3分钟，随即取出置冰水浴中迅速冷却，再将样液10000g离心30分钟，取上清液，用ELISA测CaM量。

　　2．标准曲线制备和样品测定

　　(1) CaM包被

　　在微量滴定板内准确加入100μlCaM包被液，37℃湿盒过夜，4℃湿盒72小时以上。

　　(2) CaM测定

　　测定时所有试剂均应恢复至室温。

　　① 取小试管11支，2─11号管各加DB液250μl。接着向1号管加CaM标准液(50μg/ml)500μl，然后吸出250μl至2号管，混匀后再由2号管吸出250μl至3号管，依次稀释至9号管，从9号管中吸出250μl弃去。然后在1─10号管中加入250μl抗体稀释液，11号管中加250μl NRS稀释液，涡旋混匀。前10支试管每100μl反应液分别含有2.50、1.25、0.625、0.313、0.157、0.079、0.040、0.020、0.010和0μg标准CaM。另取试管数支，每管加150μl样液和150μl杭体稀释液，混匀。将以上各管置37℃湿盒温育2小时。

　　② 从4℃湿盒取出微量滴定板，室温30分钟后，弃去包被液，用WB洗板3次，甩干。在第1─10列A、B排孔内，平行顺序分别加入1─10号管反应液各100μl，第1─8列C、D排孔内平行双孔加入100μl经样液CaM中和的抗体稀释液，第9列C、D排孔内加入11号管反应液各100μl，第10列C、D排孔内各加100μlDB液。37℃湿盒1小时。

　　③ 取出微量滴定板，甩干，用WB洗板3次。

　　④ 在第10列C、D孔内各加100μlDB液，其余每孔各加PPA稀释液100μl。

　　⑤ 37℃湿盒温育1小时。

　　⑥ 重复步骤③。

　　⑦ 在板内各孔中加入100μlOPD基质液，37℃湿盒避光温育1小时。

　　⑧ 取出板后，每孔加50μl2mol/LH₂ SO4终止反应。

　　⑨10分钟后，用吸水纸吸干板底水汽，将微量滴定板置ELISA测读仪上，在490nm条件下，以第10列C、D孔作空白调零(B)，第9列C、D孔为阴性对照(N)，测定其余各孔吸光度A值。一般情况下阴性孔A值应和空白调零孔相似，否则表明孔内样液发生了交叉污染，必须查明原因后再继续以上试验。测定过程操作顺序总结在下表中。

　　3. ．作图和计算

　　以第10列A、B孔（即零标准孔，用S₀ 表示）吸光度为最大值（结合率B%=100），第1─9列A、B孔吸光度值和B%为纵坐标，标准CaM浓度（μg/孔）为横坐标，绘制标准竞争抑制曲线（图6）。根据样品孔A₄₉₀ 值或B%，从标准曲线查出样品孔CaM含量，再按下式计算出试样CaM含量。

　　

　　本实验约需6─8小时。