抗体产生细胞的检测——溶血空斑实验

取绵羊细胞免疫的小鼠脾脏，制成脾细胞悬液，与一定量的指示细胞（绵羊细胞）和补体结合，注入自制的小室内，经37℃孵育后，单个散在的抗体形成释放抗体，抗体与周围的绵羊红细胞（抗原）结合，并在补体参与下，使绵羊细胞溶解，结果在抗体形成细胞周围形成肉眼可见的圆形透明溶血区——溶血空斑。计算溶血空斑数目，则可推算脾内存在的抗体产生细胞总数。
材料：
1. 20—22克健康小鼠
2. 解剖器械
3. 注射器，平皿，漏斗，纱布，研钵
4. 20%绵羊红细胞悬液
5. 洁净脱脂载玻片（75ⅹ25毫米），盖玻片（22ⅹ22毫米）。
6. Ph7.2的Hanks液，凡士林油。
7. 微量加样器
8. 指示细胞悬液，配制方法如下：
10%绵羊红细胞 0.5毫升
补体（新鲜豚鼠血清）0.5毫升
含5%小牛血清的Hanks液 2毫升 混合后水浴备用
方法：
1．免疫动物
取25%绵羊红细胞悬液1毫升，无菌操作注入小鼠腹腔中
2．脾细胞液的制备
（1）小鼠免疫4天后，颈椎脱位处死，取脾脏，去除脂肪组织，放平皿内，用冷Hanks液洗1—2次。
（2）取出脾脏研钵中研碎，加Hanks液2—3毫升，用吸管反复吹打数次，使细胞分散。将此细胞悬液经4—8层纱布过滤，1500转/分离心5分钟，弃上清。
如细胞太多，可加蒸馏水4毫升迅速混匀，半分钟后立即加入等量Hanks液混匀1000转/分离心10分钟，弃上清。
（3）沉淀细胞用Hanks液洗1—2次，弃上清后，加Hanks液使总量达5毫升。用乳头吸管吹打使沉淀细胞悬起混匀，此即为50倍稀释的脾细胞。
（4）取此悬液0.1毫升放另一小 试管 中然后加0.9毫升Hanks液使成500倍稀释的脾细胞悬液。
~undefined脾细胞悬液制备过程中应在冰水浴中进行。
3．玻片小室的制作
取洁净（无油）的载玻片，按下图粘三条透明胶带，在胶带上薄涂一层凡士林（勿涂到小室内），然后用镊子取两个盖片，分别放在其上，制成两个小室。用镊子尾端将盖片压平贴牢（保持小室一定体积）。用凡士林将盖片底端（其中的任一端）封住，顶端作为注入细胞混合液。

图10玻片小室示意图
4．细胞混合液的配制
取小 试管 一只，用1毫升 吸管 吸取0.2毫升指示细胞悬液，用另一 吸管 吸取0.2毫升500倍稀释的脾细胞悬液，混匀即为被检的细胞混合悬液。
5．混合细胞的灌注
用100ul的微量加样器吸取被检细胞混合悬液，于小室开口一端轻轻将液体注满小室（勿使气泡产生，勿使液体外溢），记录实际注入的细胞悬液微升数（约70ul）
每个样品注2个小室，取其平均值。
6．用牙签粘取少许凡士林益封小室开口。
7．将作好的标本水平置湿盒中，放37℃温箱中孵60分钟
8．溶血空斑计数
肉眼观察空斑并计数两个小室出现的溶血空斑数。对模糊不清的空斑可在低倍镜下检查，真正的溶血空斑必须中心有一个淋巴细胞，周围为透明区。
全脾脏中 抗体 产生细胞总数可依下述公式计算：