溶血空斑实验-抗体产生细胞总数的检测

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生物帮之抗体制备

取绵羊细胞免疫的小鼠脾脏，制成脾细胞悬液，与一定量的指示细胞(绵羊细胞)和补体结合，注入自制的小室内，经37℃孵育后，单个散在的抗体形成释放抗体，抗体与周围的绵羊红细胞(抗原 )结合，并在补体参与下，使绵羊细胞溶解，结果在抗体形成细胞周围形成肉眼可见的圆形透明溶血区——溶血空斑。计算溶血空斑数目，则可推算脾内存在的抗体产生细胞总数。

材料：

1. 20—22克健康小鼠

2. 解剖器械

3. 注射器，平皿，漏斗，纱布，研钵

4. 20%绵羊红细胞悬液

5. 洁净脱脂载玻片(75ⅹ25毫米)，盖玻片(22ⅹ22毫米)。

6. Ph7.2的Hanks液，凡士林油。

7. 微量加样器

8. 指示细胞悬液，配制方法如下：

10%绵羊红细胞 0.5毫升

补体(新鲜豚鼠血清)0.5毫升

含5%小牛血清的Hanks液 2毫升 混合后水浴备用

方法：

1.免疫 动物

取25%绵羊红细胞悬液1毫升，无菌操作注入小鼠腹腔中

2.脾细胞液的制备

(1)小鼠免疫 4天后，颈椎脱位处死，取脾脏，去除脂肪组织，放平皿内，用冷Hanks液洗1—2次。

(2)取出脾脏研钵中研碎，加Hanks液2—3毫升，用吸管反复吹打数次，使细胞分散。将此细胞悬液经4—8层纱布过滤，1500转/分离心5分钟，弃上清。

如细胞太多，可加蒸馏水4毫升迅速混匀，半分钟后立即加入等量Hanks液混匀1000转/分离心10分钟，弃上清。

(3)沉淀细胞用Hanks液洗1—2次，弃上清后，加Hanks液使总量达5毫升。用乳头吸管吹打使沉淀细胞悬起混匀，此即为50倍稀释的脾细胞。

(4)取此悬液0.1毫升放另一小试管中然后加0.9毫升Hanks液使成500倍稀释的脾细胞悬液。

~undefined脾细胞悬液制备过程中应在冰水浴中进行。

3.玻片小室的制作

取洁净(无油)的载玻片，按下图粘三条透明胶带，在胶带上薄涂一层凡士林(勿涂到小室内)，然后用镊子取两个盖片，分别放在其上，制成两个小室。用镊子尾端将盖片压平贴牢(保持小室一定体积)。用凡士林将盖片底端(其中的任一端)封住，顶端作为注入细胞混合液。

4.细胞混合液的配制

取小试管一只，用1毫升吸管吸取0.2毫升指示细胞悬液，用另一吸管吸取0.2毫升500倍稀释的脾细胞悬液，混匀即为被检的细胞混合悬液。

5.混合细胞的灌注

用100ul的微量加样器吸取被检细胞混合悬液，于小室开口一端轻轻将液体注满小室(勿使气泡产生，勿使液体外溢)，记录实际注入的细胞悬液微升数(约70ul)

每个样品注2个小室，取其平均值。

6.用牙签粘取少许凡士林益封小室开口。

7.将作好的标本水平置湿盒中，放37℃温箱中孵60分钟

8.溶血空斑计数

肉眼观察空斑并计数两个小室出现的溶血空斑数。对模糊不清的空斑可在低倍镜下检查，真正的溶血空斑必须中心有一个淋巴细胞，周围为透明区。