抗原与免疫血清的制备

实验五十四 抗原与免疫血清的制备

　　一、目的要求

　　1．学习抗原与抗体的一种制备方法。

　　2．为“凝集反应”实验准备材料。

　　二、基本原理

　　将抗原注射于动物体，使其产生相应的抗体，待动物血清中产生大量的抗体时，采出动物的血液，分离析出血清，此即含抗体的抗血清或称免疫血清。制备特异性强、效价高的免疫血清对于微生物的鉴定，疾病的诊断与治疗以及抗原的分析均有很大的用途。

　　动物产生抗体的量，一方面可因动物的种类、年龄、营养状况及刺激部位的感受性的不同而不同外，另方面还与抗原的种类、注射量、注射途径、注射次数以及注射的间隔时间有关。

　　抗原量低到一定限度时，抗体不能产生或用现有方法不能测出，但超过最高限度对抗体的产生反起抑制作用。在最低限度以上，抗体根据抗原量的增加而增加，达到最高限度时，即不再增加。每种类型的抗原，其使用量都是根据经验而得出的。本实验的抗原是细菌细胞，采用每毫升中含9亿个细菌，比较恰当。抗原初次注射后，经一段诱导期，血清内即可找到抗体，以后逐渐上升，抗体量一般不高，然后逐渐下降。但再次注射时，抗体量迅速上升到最高水平，而且维持时间也长。因此，制备抗体一般需要多次注射抗原，才能得到高效价的免疫血清。注射途径最常用的是静脉。

　　三、器材

　　24小时培养的大肠杆菌斜面， 2 kg左右的健康雄家兔或未孕的健康雌家兔；

　　硫柳汞，0．5%石炭酸生理盐水，McFarland比浊管，酒精棉花，碘酒棉花，消毒干棉花，灭菌吸管，毛细滴管，小试管，大试管与离心管， 2 ml和20ml注射器与老编号18号与24号针头，灭菌细口瓶，离心机等。

　　四、操作步骤

　　1．抗原的制备

　　(1)吸取灭菌的 0．5%石炭酸生理盐水5ml，注入大肠杆菌斜面培养物上，将菌苔洗下。

　　(2)用无菌毛细滴管吸取洗下的菌液，注入无菌小试管。

　　(3)将此含有菌液的小试管放60℃的水浴箱中1小时，并不时摇动。

　　(4)取一与比浊管同质量的小试管，加菌液1ml，再加石炭酸生理盐水4ml（或更多，视原菌液浓度而定），混匀后与各比浊管比浊。假若与第3管的浊度相等，则此菌液每毫升的细菌数为：

5×900 000 000＝4 500 000 000（45亿）

　　附McFarland比浊管配制法 用同质量同大小的试管10支按下表加入药品。

　　(5)稀释 用0．5%石炭酸生理盐水将菌液稀释至每毫升含9亿个细菌。

　　(6)无菌试验 将已稀释好的菌悬液接种少量于肉汤培养基内，培养24—48小时，观察有无细菌生长，如无细菌生长，即可放冰箱备用。

　　2．免疫血清的制备

　　(1)注射动物

　　(a)按实验五十二的方法煮沸消毒注射器与24号针头。

　　(b) 用消毒注射器抽取以上制备好的大肠杆菌抗原（抽取前摇匀），按下表所列剂量与日程注射家兔耳静脉（注射方法参照实验五十二）。

　　第14日 自耳静脉采血1ml，分离血清，测其凝集效价（参阅实验五十五），如合格即叮大量采血。

　　第16日 采血。

　　(2)家兔心脏采血

　　(a)助手的左手紧攫家兔的颈部及两只前腿，右手握家兔的后肢，使家兔仰卧，胸腹部向上，固定。或将家兔仰卧手术台上，用绳缚其四肢而固定。

　　(b)用左手在家兔肋骨左侧探得心脏博动最剧烈处剪毛，然后分别用碘酒棉花与酒精棉花消毒此部位，将右手所执注射器（注射器为20ml，针头长约35—40mm，可作采家兔心血之用）从心脏搏动最剧烈的肋骨间隙刺入心脏，若针刺准确，则此时心血涌入注射器中，徐徐抽取血液，达足量（一般每兔可抽 20 ml而不影响存活）时迅速拔出注射器，针刺处按以清洁干棉球，并立即将所得的血液以无菌手续注入一已灭菌的大试管或平皿内，尽量放成最大斜面，凝固后放入4—6℃的冰箱中，使其自然析出血清。

　　(3)制备血清

　　(a)自上述凝固血液的容器中，用已灭菌的毛细滴管分出血清，若血清中带有红细胞，则须离心沉淀以去掉红细胞。然后将血清装入灭菌细口瓶中，并测定抗血清的效价（参照实验五十五）。(b)加入防腐剂，使血清含有1/10 000硫柳汞。

　　(c)用蜡封瓶口，贴上标签，注明抗血清名称，凝集效价及日期，放冰箱备用。

　　五、实验报告

　　1．结果

　　你所制得的免疫血清，其凝集效价是多少？

　　2．思考题

　　（1）制备大肠杆菌抗原时，使用石炭酸生理盐水和加热60℃小时的目的是什么？

　　 （2）在动物体内制备免疫血清为什么要多次注射？

　　 （3）制免疫血清所用的器皿，为什么都要预先灭菌？