膜载体的酶免疫测定

　　一、斑点-ELISA
　　斑点-ELISA（dot-ELISA）的特点时：①以吸附蛋白质能力很强的硝酸纤维素膜为固相载体；②底物经酶反应后形成有色沉淀，使固相膜染色。在实验室中斑点-ELISA可按下法进行。在硝酸纤维膜上用铅笔划成4mm×4mm的小格，在每格中央点加抗原1～2μl，成为一个小点。干燥后将每格剪下分别放入ELISA板孔中，按ELISA方法操作，最后加入能形成不溶性有色沉淀的底物，如在膜上出现染色斑点，即为阳性反应（图15-11）。因硝酸纤维素膜吸附性能强，一般在包被后须再进行封闭。如将硝酸纤维素膜裁剪成膜条，并在同一张膜条上点有多种抗原，将整个膜条与同一份血清反应，则可同时获得对多种疾病的诊断结果。斑点-ELISA的缺点是操作麻烦，特别是洗涤的操作很不方便。

图15-11 斑点-ELISA示意图
　　应用斑点-ELISA的原理，通过特殊工艺已制备出各种 试剂 ，供临床检验用。一般分三种类型：①将 试剂 膜粘贴在塑料条片，便于洗涤和观察。②将试剂膜封在小盒内，膜下垫吸水剂，洗涤液通过膜吸入盒内。此即斑点免疫渗滤试验（见第十九章）。③将试剂膜固定在小杠框格中放入特殊的自动分析仪中检测。应用这一系统可做各种蛋白质、激素、药物和抗生素的定量测定。
　　二、免疫印迹法
　　免疫印迹法（immunoblottingtest，IBT）亦称酶联免疫电转移印斑法（enzymelinkedimmunoelectrotransferblot，EITB），因与Southern早先建立的检测核酸的印迹方法Southernblot相类似，亦被称为Westernblot。免疫印迹法（图15-12）分三个阶段进行。第一阶段为SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳（SDS-PAGE）。抗原等蛋白样品经SDS处理后带阴电荷，在聚丙烯胺凝胶中从阴极向阳泳动，分子量越小，泳动速度就越快。此阶段分离效果肉眼不可见（只有在染色后才显出电泳区带）。第二阶段为电转移。将在凝胶中已经分离的条带转移至硝酸纤维素膜上，选用低电压（100V）和大电流（1～2A），通电45min转移即可完成。此分阶段分离的蛋白质条带肉眼仍不可见。第三阶段为酶免疫定位。将印有蛋白质条带的硝酸纤维素膜（相当于包被了抗原的固相载体）依次与特异性抗体和酶标第二抗体作用后，加入能形成不溶性显色物的酶反应底物，使区带染色。常用的HRP底物为3，3＇-二氨基联苯胺（呈棕色）和4-氯-1-萘酚（呈蓝紫色）。