Gateway技术：克隆、表达新方法

Gateway技术提供以下可能： 通过去除冗长的亚克隆步骤节省您的时间

同时将您的基因转移到多个表达系统

在任何您选择的系统――体外，细菌，酵母，昆虫，或哺乳动物――分析表达

一、一种更好的克隆方法

Gateway技术能够克隆一个或多个基因进入到任何蛋白表达系统（图1）。这项强大的体外技术大大地简化了基因克隆和亚克隆的步骤，而同时典型的克隆效率高达95%或更高。当基因在目的表达载体之间快速简便的穿梭时，还可以保证正确的方向和阅读框。Gateway也有助于进行带不同数目纯化和检测标签蛋白的表达。

图1 Gateway技术的灵活性

目的基因克隆进入门载体后，可以同时转移目的基因到多个目的载体。

Gateway利用了位点特异重组，所以在构建入门载体后，不再需要使用限制性内切酶和连接酶。一旦您拥有了一个入门克隆，就可以多次使用它，转移您的目的基因到Gateway改造过的各种表达载体（目的载体）。

此外，由于在重组时DNA片段的阅读框和方向保持不变，因而您不必再为新的表达克隆测序担心。在使用每一种新的表达系统时，将会节省您更多的时间。

二、一项强大而可靠的技术

Gateway技术是克隆和亚克隆DNA序列的一项新颖的通用系统，便于功能基因的分析和蛋白质的表达。一旦进入这个多功能的操作系统，DNA片段可以通过位点特异的重组在载体之间转移。

Gateway技术是基于已研究的非常清楚的λ噬菌体位点特异重组系统（attB x attP →attL x attR）。BP和LR两个反应就构成了Gateway技术（表1和图2）。BP反应是利用一个attB DNA片段或表达克隆和一个attP供体载体之间的重组反应，创建一个入门克隆。LR反应是一个attL入门克隆和一个attR目的载体之间的重组反应。LR反应用来在平行的反应中转移目的序列到一个或更多个目的载体。

表1 反应和术语总结

反 应	反应位点	产 物	产物结构
BP反应	attB×attP	入门克隆	attL1-基因-attL2
LR反应	attL×attR	表达克隆	attB1-基因-attB2

图2 Gateway技术总结

在BP反应中基因转移形成入门克隆，在LR反应中入门克隆可以作为反应物产生最终的表达克隆。

完成构建Gateway表达克隆仅需两步（图2）：

（1）创建入门克隆，通过PCR或传统的克隆方法将目的基因克隆进入门载体。

（2）混合包含目的基因的入门克隆和合适的目的载体以及Gateway LR Clonase酶，构建表达克隆。（表达克隆用来在合适的宿主中进行蛋白的表达和分析。）

有几种方法可以构建Gateway入门克隆。无论您选择何种方法，创建的入门克隆都是准备用来与各种目的载体进行重组。

（1）PCR克隆（定向TOPO克隆至入门载体或与供载体B×P重组）

（2）限制性内切酶消化和连接进入入门载体

（3）使用pCMV•SPORT6或pEXP-AD50undefined构建Gateway兼容cDNA文库

（4）Gateway改造过的克隆资源~K~Hp~M~2~1~Kp~undefined 这些克隆资源和cDNA文库两边加有attB位点。这些克隆可以通过与供载体及BP Gateway酶反应转换到入门载体。获得已有克隆资源的更多信息。

三、PCR定向（PCR-Directional）TOPO克隆

定向TOPO克隆使得克隆PCR产物和其它的DNA分子更加快速和有效。进行5分钟的简单连接，产生>90%的重组子。您不仅会比用连接酶介导的方法更快的获得克隆，而且可以节省因第一次无结果而重复试验所额外浪费的时间。

定向TOPO克隆提供高效的一步法克隆策略，可以定向克隆平端PCR产物到入门载体。平端PCR产物定向克隆的效率>90%，从而简化了筛选。同时不再需要连接酶、PCR后续步骤或者限制性内切酶。

目前有两种定向TOPO克隆载体。pENTR/D-TOPO 和pENTR/SD/ D-TOPO（表2和图3）有以下特点：

 位于PCR产物插入位点两侧的attL重组位点可以与Gateway目的载体进行有效重组

 通用M13位点便于测序

 基于pUC的ori位点提供高产量质粒

 大肠杆菌中卡那霉素（kanamycin）抗性基因筛选

表2 两种pENTR/D-TOPO载体的简单比较 

入门载体	特 点	优 点
pENTR/D-TOPO	无SD （Shine-Dalgarno）位点	真核细胞中天然、N-或C-端融合；大肠杆菌中N-端融合；如果基因包含有SD序列，可在大肠杆菌中进行C-端或天然蛋白表达
pENTR/SD/ D-TOPO	含SD （Shine-Dalgarno）位点	包含基因10和一个SD序列，可以有效的启动天然蛋白和融合蛋白在大肠杆菌中的表达

图3 Gateway定向TOPO克隆

四、构建入门载体的各种选择

1、限制性内切酶消化

作为PCR克隆的替代方法，有5种Gateway入门载体可以使用传统的限制酶切和连接的方法产生入门克隆。这些载体配合合适的目的载体，可以用于表达天然蛋白或带有N端或C端融合标签的重组蛋白。为了在真核细胞中有效地翻译蛋白，所有的5个Gateway入门载体提供了Kozak 序列。此外，pENTR11提供了SD （Shine-Dalgarno）序列，便于在大肠杆菌中有效的翻译。

2、PCR重组克隆

重组是从PCR产物创建Gateway入门克隆的另一种方法。这种方法是通过合并attB位点到上游和下游引物上，然后共同孵育PCR扩增产物和pDONR载体（包含attP位点）以及Gateway BP Clonase酶混合物。接着转化进大肠杆菌中，您将会获得包含目的基因的入门克隆，同时目的基因两侧具有attL重组位点。这个入门克隆可以与任何Gateway目的载体进行重组（参看图2）。

3、Gateway改造过的cDNA文库

如果您已经有了用Gateway兼容载体构建的cDNA文库，您就可以通过pDONR载体和BP Clonase酶混合物进行一个简单的重组反应，很容易地把单个克隆转换成Gateway入门克隆。这样就不再需要亚克隆和测序，为您节约数小时的时间。

SuperScript cDNA文库使用pCMVSPORT构建，有几种人组织来源可供选择，这些文库有很大一部分是全长的插入片段，可以完全代表来源mRNA。

4、入门克隆的切入点——克隆资源

您可以从与10000个人类基因相关的35000个克隆中进行选择，这些克隆的70%以上是全长序列的。这些克隆来源于使用特殊的高级cDNA文库构建技术、oligo dT引物以及SuperScript II 反转录酶所构建的文库。许多克隆来源于I.M.A.G.E.协会，NCI CGAP 项目，ResGen库或UltimateORF库。

克隆资源因为已克隆到Gateway改造过的载体，所以可以快速地将基因转到各种表达系统中。

图4 进入Gateway系统的各种路线

五、触手可及的最高级表达系统

一旦您构建好Gateway入门克隆，蛋白表达和分析的大门就会向您敞开。使用Gateway技术，您可以进入到几乎是无数种的表达系统。因为没有一个单一的表达系统蛋白适合于每一种蛋白，优化基因表达的最好方法是在多个系统中分析您的蛋白（图5）。

图5 在Gateway系统表达全长开放阅读框

 

大肠杆菌GUS基因、人类MAP4和Eif-4E基因平行转移进目的载体，在Sf9昆虫细胞（杆状病毒）或大肠杆菌BL21-SI菌株表达天然蛋白、N-端His或N-端GST融合蛋白。在所有的系统中均观察到GUS良好的表达，而MAP4只在昆虫细胞中表达，Eif-4E只在大肠杆菌中表达。在Hartley， J.L.et al. (2000) Genome Research 10(11):1788-95 可以找到更多的细节。

为了扩展表达的选择，Invitrogen 已将Gateway技术合并到部分最高级的表达系统中。无论您选择哪个系统――体外，细菌，酵母，昆虫，或哺乳动物――都可以获得Gateway目的载体。此外，你可以很容易地把您自己最称手的表达载体转换成Gateway目的载体。