提取细胞 RNA 的方法

一、细胞总 RNA 的提取

1、6 孔板细胞汇合度为 90-100% 时，取出无菌室，去其上清，用 PBS 洗两次后，每孔加 TRIZOL 试剂 1 ml，摇匀，无菌罩内消化 3-5 min。

2、将各孔内消化好的细胞裂解液吸到一 DEPC 处理过的 1.5 ml EP 管中，加新开的氯仿 0.2 ml，轻摇15 s。

3、室温静置 2-3 min后，12000 rpm，15 min，4 ℃，离心。然后取上清无色水相（约 0.6 ml）到 EP 管（DEPC 处理过），加 0.5 ml新开的异丙醇，室温下静置 10 min。

4、12000 rpm，10 min，4 ℃，离心。观察总 RNA 在管底的白色沉淀，弃去上清，75%乙醇 1.0 ml洗涤（用DEPC水新配制）后，7500 rpm，5 min，4 ℃离心。

5、去上清，点离，用小 Tip 吸干液体。气干沉淀 5-10 min， DEPC 处理水 20-30 μl 加入，中枪打匀，55-60 ℃水浴 10 min溶解总 RNA，测 OD 值。

6、电泳。

二、从总 RNA 中分离 mRNA（Oligotex mRNA Mini Kit,Cat.no.:70022, QIAGEN）

1、取上述提取的总 RNA 若干（少于 0.25 mg）到一个新的无RNase 的 EP 管中，用无 RNase 的水定容到 250 μl。

2、加入 Buffer OBB 250 μl, Oligotex Suspension 15 μl。用 Tip 打匀或用手弹匀。

3、70℃ 水浴，3 min（裂解 RNA 的二级结构）。

4、20-30℃ 条件下，静置 10 min（让 Oligotex 与 mRNA 结合）。

5、高速离心 2 min，小心吸走上清（该上清要保留），留下约 50 μl的上清在原管里。

6、用 Buffer OW2 400 μl重悬含 Oligotex/mRNA 复合物的沉淀，然后将这些加到套有 1.5 ml EP 管的 SPIN 柱子上，高速离心 1 min。

7、将 SPIN 柱子移到一个新的 EP 管上，加 Buffer OW2 400 μl到柱子，高速离心 1 min，丢掉滤过液。

8、将 SPIN 柱子移到一个新的EP管上，加 20-100 μl 热的（70 ℃）Buffer OEB 到柱子上，用 Tip 来回吸打 3-4 次，高速离心 1 min。

9、为保证最大的 mRNA 产量，可再次重复第 8 步。

10、电泳。