实战指南——免疫共沉淀篇（进阶）

互联网2013-02-18

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一、IP前的准备工作：

coIP：分为内源性蛋白的相互作用和非内源性蛋白相互作用（后者包括外源蛋白之间以及外源拖内源蛋白）。

非内源性蛋白的相互作用，主要是通过过表达来实现，通常为简化实验、提高IP效率会让外源蛋白带上标签（tagged；这也是没有相应的可用于IP的内源蛋白抗体之前唯一可行的方案），因此就tag的使用而言存在很多小技巧。

1. His-tagged主要用于纯化蛋白。有些人喜欢用His-tagged蛋白然后进行coIP，实际上它存在潜在的隐患。当初鄙人用Sigma a-His（鼠单抗；免费广告）WB外源蛋白发现CE里面一塌糊涂（带型漂亮就是非常多的带），那时候还抱怨这个抗体特异性不好。后来，当了解到很多蛋白会有富含histidine的domain以后，恍然大悟，恰恰是因为效价非常好，所以很多内源性的蛋白都被该抗体识别。同理，如果用Ni-NTA beads去PD His-tagged的蛋白，完全有可能PD那些内源性的富含histidine domain的蛋白，造成coIP的假象，而这样的蛋白还非常多。

2. tandem-tagged不能用于分析钙调信号通路。tandem tag实际上从成本角度和His tag差不多，洗脱试剂价格低廉，因此可用于大规模PD之后的质谱分析，能获取最全面的相互作用的信息。然后由于其中包含钙调蛋白相互作用domain，天然会结合钙信号相关蛋白，从而干扰或掩盖靶蛋白与钙信号蛋白之间的相互作用，有一定的应用局限。当然，笔者不太清楚近年来该方法有无改进，但正是由于引入钙调domain才实现了降低成本的目的，因此猜测可能性不大。

3. Myc、HA、Flag-tagged：

Myc仍然会有天然的干扰，应用略有局限；相较后两者是人工合成专门用于tagged蛋白（有相应的专利，因此目前无论抗体或交联好的beads价格都非常昂贵），因此干扰最小、最常用。如需进一步细致区分，a-Flag效价比a-HA略高，因此更适合IP。当然，公司仍在努力寻找效价更好的a-HA以及IP HA的抗体（Flag系Sigma专利，因此目前只能忍受其过高的定价）。那么，之前颇流行的a-HA鼠源单抗（其clone名称为12CA5）为何被潜在地摒弃了？

原因大概是：该克隆株可以轻易获取，流传甚广，因此可以取腹水自制；效价不高，特异性很差。尤其是特异性的问题，用该抗体去交联的beads做coIP，隐患很大（可以轻易PD非常浓的非特异性蛋白）——因此，购买商品化a-HA beads时，请仔细阅读产品说明（避开12CA5系列）。

4. tag的位置。将tag构建到蛋白的N端还是C端，也是一个潜在的能够影响coIP结果的因素。比如，分泌蛋白的N端通常有分泌信号肽，如果将tag构建到N端，则外泌时会被信号肽酶连同信号肽一起切除；所以这时必须构建在C端。再如，多数蛋白的C端是疏水区，有的时候将tag构建在C端会影响蛋白原来的空间结构，如恰好C端同时是相互作用的结构域，某些时候还可能被遮蔽，从而干扰相互作用。因此，通常构建质粒的时候是N端、C端tagged同时分别构建，以备万一。

内源性蛋白的相互作用，主要依靠抗体IP，WB或者质谱分析。另外一条途径，是用外源性蛋白的coIP指代内源性蛋白，上文提到的tandem-tag技术的目的就是为了实现这种可能。它的核心是将外源性蛋白的过表达降低极低水平用于模拟体内环境。

实际上，在构建外源过表达体系的时候，通常可以得到一系列表达水平差异的稳定单克隆，可以通过进一步筛选获得外源与内源相加与原内源蛋白水平相当的细胞株（在细胞调控承受的范围以内，内源性蛋白水平会因为相应的外源蛋白表达而适当下调），这样的细胞株可以用于模拟内源性蛋白的相互作用；因为理论上未改变细胞的生理特异，相应的生命过程仍受内源因素调控。

当然构建相应的细胞株需要转染并筛选，又因为要控制表达量水平，筛选工作耗时更长；并且细胞状态会因为传代过多而有些改变。因此，绝对的内源性蛋白的相互作用仍是一个不可或缺的数据，尤其对一个新发现的蛋白复合体。

IP内源性蛋白首先要确认相应的抗体是否能够用于IP。能够用于IP的抗体，通常其识别区域恰是天然状态下靶蛋白暴露于外的区段，常为疏水性结构域；因此在自己制备抗体的时候要更多考虑这个因素，至于商品化的要仔细阅读说明。

在确定抗体可以用于IP A蛋白以后，抗体投入量如何掌握呢？通常情况下0.1ug-3ug较常用（纯化的抗体），其变化取决于抗体的效价，但通常未知情况下0.5ug或1ug是最常用。一般如果样品易制备则尽量用样品过饱和抗体，让投入抗体能物尽其用；相反，通常1ug抗体已经是过量的。

另外一个需要考虑的因素是B蛋白的大小，尤其B蛋白已知。当B蛋白分子量接近55KDa或24KDa附近的时候，问题会比较复杂。因为在最后一步洗脱的过程，很容易将轻链和重链带入到IP终产物，它将严重干扰实验结果。

二、解决方案

1. IP外源tagged-A蛋白，洗脱尽量用相应的peptide，一方面提高特异性，另一方面由于洗脱条件温和，重链和轻链脱落也会较少；在IP前，尤其对于新Flag、HA beads可以用washing buffer或者低pH Glycine-HCl漂洗一下beads，把结合不牢的重链和轻链先洗掉。此外，Flag、HA-beads通常是鼠抗，那么IB B蛋白的抗体应该选用兔抗。

针对beads的新旧，反过来说，采用再生的旧beads有利于避免轻重链的干扰，且IP前的封闭可以省去——不要指望高盐、酸洗能彻底去除已经非特异结合到beads上的杂质，通常这些蛋白都比较黏。高盐、大量纯化蛋白时，采用再生的beads可以获取即便银染，背景仍非常干净的高纯度蛋白样品。

2. IP内源性蛋白，尤其最后涉及低pH Glycine-HCl洗脱或者SDS LB煮beads（后者重、轻链更严重），如B蛋白为60KDa即能与55KDa重链分开时，且抗体效价许可的前提下，降低抗体投入量会显著减弱重、轻链信号，从而不会使得B蛋白信号不致被重链信号吞没；若有条件再配合交错抗体种属来源，即IP A蛋白的抗体为兔抗，IB B蛋白用兔抗以外任何一种诸如鼠抗、羊抗；反之亦然。

即使交错抗体的种属，实际上当重轻链脱落过多时（尤其是重链），在IB的时候它符合《WB实战指南》提到的杂蛋白过浓会非特异结合任意抗体，这在coIP的实验结果分析中要格外小心。有人会说可以用未免疫的IgG做阴性对照，但是偶尔会发生一些未知意外，恰好IgG的重链没有显影（毕竟这不是抗原抗体特异性结合）。

BTW：偶尔这样的结果还能重复出来，但是反过来IP B蛋白，IB A蛋白可能就100%失败。所以，当蛋白分子量接近重、轻链的时候，下结论要格外小心，除严格阴性、阳性对照外，reverse IP的结果也很重要。最好加一个不相干的蛋白的同种属的抗体做阴性对照

beads封闭和样品的preclear：

如果采用新beads，beads的封闭就显得非常必要。封闭用1-5mg/ml BSA（ChIP还要加鱼精DNA）扔buffer里一直静置就好了；若临时添加可考虑翻转半小时；样品preclear用protein A beads翻转半小时。实际经验，杂蛋白若是很黏怎么处理都只是相对好一些。所以，IP、漂洗的盐浓度影响更大。

coIP：

抗体剂量上文提过了；其他flag、protein A等等beads一般用10ul足够了，偶尔根据需要微调，诸如过表达纯化蛋白。总之，一般CE的成本较低，若用CE饱和抗体、beads，只要你抗体、beads和操作始终一致，最后IP的A蛋白能保证一致，结果有效。

干粉状的beads用IP buffer充分溶胀后离心去beads的碎片；其他液态的不需要此过程。现在市售的商品化beads如sigma flag可不需要IP buffer漂洗直接IP，未发现对coIP结果的明显干扰。通常，再生的beads由于放置-20度延长保存期需要加入大量甘油，不漂洗直接使用不容易把beads分匀，从而造成不同tube间初始差异，这时候会对IP结果影响很大。

用抗体做内源性IP时，个人喜欢抗体2hr+beads 1hr，抗体孵育可过夜；beads不超过3hrs（含flag等等标签蛋白IP情况）。这里面提到一个细节，就是先加beads还是先加抗体。在某些情况下，CE离心去除细胞碎片后的上清是一个刚好的溶解平衡体系，添加其他物质如beads这类可作为沉淀凝结核的物质会破坏原本的溶解平衡；它可能类似水蒸气凝结成雨水或雪花需要灰尘作为凝结核，其结果就是让一些原本溶解完全的蛋白发生沉淀。

那么，beads翻转越久蛋白会沉淀越多，而这种沉淀无法靠漂洗去除干净，最终进入sample从而可以检测到任意蛋白的结合。因此，限制beads翻转孵育时间非常关键；通常beads孵育1-2hr已经充分结合了。

做IP的beads其物理性质跟吸附DNA的或诸如Ni-NTA之类的差异很大，不需要高速离心，通常台式小离心机4-5K、30sec就足够了；有时候忘记了，静置较久beads已自然沉降甚至不需要离心。在这种情况下，不必要的高速离心只会给beads施加巨大的离心力，次数多了beads通通碎裂，严重影响再生beads的质量——避免一些不必要的操作；当然不打算重复使用就无所谓了。

三、Beads再生

商品化的beads尤其抗体交联的，因为抗体和专利的原因价格相对昂贵，那么回收beads并再生就显得非常必要。保管得好（防霉变），beads可以重复用20-30次。

再生beads没有什么特别的，常做生化柱层析的，那简直就是家常便饭。IP用beads的再生，也无非就是高盐接酸洗再高盐，最后用IP漂洗buffer复性，加甘油和NaN3扔-20度长期保存。

高盐即3M NaCl；酸洗，就是可用做elution buffer的0.1M pH3.0的Glycine-HCl。IP beads尤其抗体交联的，由于昂贵再加实验和回收过程的损失一般体积不大，所以Biorad公司一种小型塑料的柱层析管用来再生beads最合适（它是一次性的，但仅仅用于再生beads可以无限重复使用）；而常规的玻璃生化层析柱即便最小号的也太大，黏壁损失会很大，beads再生几次可能就全损失了。

再生操作就类似做DNA大抽的KIT，加液体到层析柱、控制流速让其一滴滴流下；再生质量可以通过改变酸、盐的体积控制，希望干净点多加一些、多洗几遍。

唯一需要注意的，由于再生流程通常要耗费半天时间，beads太少不值得操作且再生次数越多黏壁损失也越多；所以，通常都是等回收的旧beads积攒到一定体积再一次性操作。前文提过，IP用的beads通常不需要离心就会自然沉降，而积攒旧beads通常是一个很漫长的过程，那么等到决定再生的时候，beads可能因为静置过久而已经压挤得非常结实；直接重悬beads转移到层析柱里，你会发现液体根本流不下来。

因此，对于静置很久的旧beads通常在回收前一天高速翻转过夜，这时候再把beads转移到层析柱中就会相对疏松，酸、盐洗涤就会比较流畅。同样的原因，再生过程中通常就是流速越来越慢，再生次数多的旧beads其内含的灰尘、颗粒也较多，可能最后液体就不滴了；这时候只能用枪反复吹吸、松松beads。当然，这些问题都只在beads体积较大的时候时明显，如果本来就不足1ml，以上就全是废话。