RNAi及siRNA转染相关实验攻略

互联网2013-09-05

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RNAi 是一种高效的特异性强的基因表达抑制，应用RNAi生物学机制进行基因功能研究已经成为一种创新性的新方法，人们第一次可以如此快速和方便地抑制细胞中特定基因的表达水平，从而用于分析特定基因在细胞中的功能。RNAi 技术还为新药开发、疾病治疗提供了创新性的方法和途径，有着极其广阔的应用前景。转染是RNAi技术应用的瓶颈。siRNA的转染是RNAi技术最常用和最重要的转染。由于siRNA转染技术应用的时间不长，对广大实验室和研究者来说还相对陌生，即使一些有经验的研究者也有一些疑问和困惑。

一、详细实验
RNA干扰（转录后基因沉默）实验
 细胞转染实验

二、常见问题解答
1、问：都说RNAi很容易降解，转染效率很低。一般采用什么策略和技术来防范呢？
答：RNAi中，标准的非修饰的siRNA确实容易降解，这不仅在保存过程中，而且在转染过程中。

对siRNA的降解，可以合成修饰的双链siRNA，以提高合成中的稳定性，使用合成好的siRNA，尽量严格做到不要受RNA酶的污染。

对转染来说，因为要接触血清，培养基以及细胞内酶的作用。这时，好的转染试剂作用就显现出来了。要做到在血清中游离时，保护siRNA不受培养基中酶和蛋白的降解、吸附等影响，同时在进入细胞后不被溶酶体降解，并能释放到细胞质中。好的转染策略还不仅有保护的作用，更重要的是浓缩siRNA，不将细胞外的其他成分，特别是毒性成分，如抗生素、过多的蛋白带入细胞，以避免细胞产生毒性反应，毒性对RNAi实验来说，影响非常大。

2、问：最近用Entranster-R做NIH3T3细胞的siRNA转染，沉默效率在50％左右，请问如何提高沉默效率？
答：不知道您的具体用量，但一般可以从几个方面来提供沉默效率：

（1）优化siRNA和转染试剂的用量。具体优化方法可以在Entranster-R的说明书上看到。经过优化后，据我们和客户的经验，对NIH3T3，沉默效率应该可以达到80％以上。

（2）在沉默的峰值点观察结果，如在mRNA水平，可在24-48小时观察，在蛋白水平，可在更长时间如48-72小时观察。具体时间根据具体基因的表达情况确定。

（3）优化转染时的细胞数量。转染时较少的细胞数量，可延长观察时间，同时避免由于细胞密集造成的抑制。

3、问：21nt,22nt,24nt的siRNA如何进行电泳分辨？

答：可以采用化学修饰的方法，比如2'羟基甲基化修饰，磷酸硫代修饰，氟代修饰等常规修饰方法，都可以保证siRNA的稳定性，当然也有学者可以在siRNA的链后面悬挂两个单独碱基T。还有就是合成和纯化以及实验操作中的尽量注意RNA降解即可。PAGE分析，即聚丙烯酰胺凝胶电泳，理论上可以分辨1bp，实际上，在引物的纯化中也常用此种凝胶进行纯化。但由于siRNA很容易降解，尤其在电泳时，需要接触的液体、器皿等都很多，很容易造成在电泳过程中的降解，这样电泳就不易分辨了。如果一定需要分辨，可以采用HPLC或质谱的方法。

4、问：我在做shRNA质粒，用lipo2000转染U251细胞。这两天做了一次，用RT-PCR来看转染后抑制的效果。公司给我四个质粒、一个阳性对照、一个阴性对照。按照lipo的protocol，DNA：lipo比例为1：3，转染近30个小时提的RNA。结果出来让我有点茫然，四个质粒确实有抑制，抑制率大约在50%左右。但是问题出来了，阳性对照是针对GAPDH的，但是我阳性对照的GAPDH跑出来条带非常亮，而阴性对照却基本没有GAPDH。应该不是加样加错了？楼主能不能帮我分析一下？
答：（1）四个质粒都有抑制，包括阳性和阴性对照，都在50％，如果是，阴性质粒是不应该出现抑制的，可考虑增加转染试剂对照，即不加任何质粒，只加转染试剂，或者换一种转染试剂，看是否是lipo2000转染试剂造成的抑制。（2）如果是阴性对照呈阳性，而阳性对照呈阴性，当然首先得排除操作中混淆的错误，可以再重复一次实验。

（3）转shRNA质粒，建议可以时间再长些，如48-72h再提RNA，观察结果。

5、问：想请教下有人提到siRNA与lipofectamine2000的最适比例为1：1或1：2，这是什么比例呢？我看一般siRNA以pmol为单位，而lipofectamine2000是以ul为单位。还有就是siRNA的终浓度问题，一般文献中提到转染时siRNA的终浓度为100nM,这是指与稀释后与脂质体混合后的浓度，还是指培养板中加了生长培养基后的终浓度呢？还有荧光如何计算它的转染效率呢？那在荧光显微镜下怎么选取视野来计算呢？取三个视野后算平均值吗？
答：不同的细胞，不同的基因，用量是不一样的。终浓度指：细胞接触的液体的终浓度，即含培养基的浓度。带荧光的siRNA，可以通过荧光显微镜、流式细胞仪等来看。有荧光的细胞所占比例就是转染效率。精确的方法是用FACS，荧光显微镜下可以选有代表性的视野估计。多选几个视野，如你说的3个，当然更为可靠。

6、问：想请教个问题，我是用lipofectamine2000来转染，细胞本身有些小黑点，但不严重，细胞形态功能都还可以，但是在加了转染试剂之后细胞间就出现很多很多小黑点，背景很不干净，实验组，阴性对照组和Mock组都是一样的情况，但正常组（不加转染试剂）的细胞就很好,72h后mRNA检测实验组几乎没有抑制，请问这是转染试剂的原因吗？
答：应该先确定一下“小黑点”的性质，不过根据你的描述，应该和转染试剂有很大关系。脂质体类的转染试剂多对细胞毒性较大。

7、问：慢病毒转染多长时间后进行干扰目的基因和蛋白的检测？
答：如果用慢病毒进行瞬时表达，一般至少需要24-48小时，慢病毒基因组是RNA，需要反转录成DNA，再生成siRNA，再干扰，才会发生作用。这个过程和细胞类别、细胞活性、慢病毒具体载体等等有关系。建议取不同时间点检测。另外，慢病毒一般都带筛选基因，可以考虑做稳定表达。如果只做瞬时表达，可考虑用转染试剂，成本、时间、方法都要省很多。

8、问：ipo的说明书中说到，用96孔板，可以在板内直接混合lipo、DNA，然后再加入细胞。但是有点疑问，按照说明书说的，lipo、DNA都需要和opti-MEM预混合，然后再将两者的溶液混合孵育，不知道直接加到板子里面时，加样顺序怎么弄？是先加opti-MEM，然后加DNA，然后再加opti-MEM，再加lipo，混合孵育么？

答：lipo2000的说明书有好几个版本，有一版说明书是不用于转siRNA的，后来又改成可以转siRNA，但推荐用RNAimax这款siRNA专用的转染试剂，你看的应该是其96-well反向转染的说明书。是会让人费解。其实是，先在一个容器用opti-mem稀释lipo，再在板子里用opti-mem直接稀释DNA或siRNA，然后将稀释的lipo加入到板子上，最后加细胞。

9、问：我最近也在做转染，可是发现转染后背景很脏，都是黑点（疑似黑焦虫）在原地运动。做了LB检测，确定该黑点不是细菌，最后发现黑点来源于抽提的质粒，请问LZ有什么办法可以解决吗？我已经用试剂盒重新抽提过N次质粒了还是这样？

答：这种黑点，如果确定不是细菌，多是凝聚的蛋白，还有DNA等的沉淀产物，有人又把它叫“黑胶虫”。人们看到可以动，认为是生物，其实只是布朗运动。这和血清、细胞、转染试剂等都有关系。如果不影响实验，可以通过换液来除去。

10、问：如何确定构建的载体表达了shRNA呢？我的载体U6启动子下游有个CMV+GFP，GFP如果有荧光的话，能否直接说明表达了shRNA呢？

答：确定shRNA表达的最好的方法是通过western Blot、qRT-PCR等，能直观观察到蛋白表达量的变化。如果采用基因表达和shRNA表达组合的方法，个人认为并不能完全说明上游基因表达了，下游的shRNA也同时表达了，如果发文章，仍然需要其他实验来佐证。

11、问：lent-ivirus转染时是否可以用无血清的培养基？

答：一般都用含血清的培养基，无血清培养基只要细胞能耐受，是可以的。

12、问：第二代慢病毒包装系统和第三代慢病毒包装系统有什么区别吗？

答：因为慢病毒包装系统来自HIV病毒，第二代慢病毒载体系统比第一代，从安全性角度又去除了HIV的所有附属基因，第三代慢病毒载体又进一步做了些安全方面的改进，如删除了U3区的3′LTR和tat基因。目的都是希望通过重组成为HIV病毒的可能性降到最低。这是主要的区别。

13、问：请问RNAi转染后几个小时观测靶基因的表达变化啊，24个小时是最佳么？

答：如果转siRNA，在mRNA水平，建议24-48h看结果，在蛋白水平，建议48-72h看结果。

14、问：RNAi转染后的细胞，密度有些高，想做48H和72H的时间点，不知能不能把细胞传下代啊？有人这么做过吗？

答：不建议传代，传代会死亡丢失一些细胞，这会影响结果。

15、问：RNA干扰如果用慢病毒做稳转的细胞株，什么样的目的RNA都可以用来干扰来做稳转的细胞株吗，目的RNA所编码蛋白的作用跟能不能稳转有关系吗，若能稳转，这个筛选的过程大概是多长时间呢？

答：当然不是任何mRNA都适合建立稳转的细胞株，这里面有两个前提，一是细胞能稳定存活传代，二是某mRNA被稳定的干扰掉。这两个前提必须同时存在才算成功。换句话说，如果某mRNA被干扰会导致细胞不能存活或无法稳定传代，自然无法建立这样的带RNAi的稳定细胞株。

16、问：对于流式分选我不是很清楚，需要什么样的条件呢，对仪器有什么要求吗，不知道我们实验室有没有这样的条件，还有这种分选办法是不是需要多次摸索仪器的条件呢？

答：采用流式分选是流式细胞仪的一个功能，有流式细胞仪就可以了。一般实验室对流式都有专门的人员操作，不需要自己动手。由于没有抗性，需要注意分选过程的无菌操作。

17、问：现在准备做癌干细胞RNA干扰前后的细胞生物学行为，是siRNA 还是shRNA 的效率好呢？

答：有条件的话，可以都采用，一方面可以互相验证，另一方面可以充分利用时间。

18、问：用慢病毒来包装siRNA来转染细胞，如何确定转染成功的细胞具有稳定性？这种细胞最多能够稳定传代多少代啊？

答：我理解你的稳定性是指在子代细胞中也同样出现RNAi效果。瞬时转染的siRNA会在培养传代过程中，不断被降解稀释，以至消失。如果需要在子代中也永久有RNAi，必需将相关siRNA基因整合到细胞基因组中，并表达。一般来说，如果感染并传代2周以后，RNAi效应仍然非常明显，可以初步认定是稳定的。稳定传代的细胞系根据细胞的不同，可以传很多代的。

19、问：最近构建了一个水稻的shRNA 载体，形成的双链部分（stem）由210pb的长度，中间有120bp的环状结构（loop），但是做pcr扩增表达shRNA的DNA部分总是不能成功，不知对这种结构的DNA的扩增有什么特别要求。

答：问题的关键是关于loop结构的PCR扩增问题，这种PCR据我所知一般多采用多对引物，分段扩增。

20、问：用质粒转染原代小鼠星形胶质细胞效率怎么样，用lipo转？

答：原代小鼠星形胶质细胞有文献报道可以用lipo转，但我们用lipo转染不成功。

21、问：SiRNA 和shRNA有什么区别呢？

答：区别很多。简单地说，shRNA在细胞里，经过相关酶切，产生siRNA。

22、问：刚开始做实验，准备把RNAi的片段转入染色体内稳定表达，不知道是shRNA还是siRNA哪个比较好而且效率比较高？另外想咨询下，一个载体里同时放两个针对不同基因的shRNA会不会相互影响？

答：稳定转染当然是shRNA。关于一个载体2个shRNA，涉及到2个shRNA的表达和加工的问题，关键还是2个shRNA都需要顺利表达的问题，这就和你的载体，以及2个shRNA在载体的排列有关系。至于蛋白之间的相互影响，估计你应该考虑到了。

23、问：我转的是昆虫细胞，dsRNA的浓度为2.3ug/ul，如果加到六孔板时，需要加入多少微升？用的转染试剂是lipo2000。还有培养基用FBS的培养基，里面是否还有RNase也不敢确定，有必要用专门的培养基吗？

答：具体的实验参数需要通过梯度实验确定。培养基的问题，一般不需要专用的培养基，lipo2000对培养基有要求的，这个你按照他的要求来进行。

24、问：如果我只想筛选干扰的有效序列,有必要做G418稳定细胞系的建立吗?只做瞬转可以吗?

答：筛选有效序列，通过western blot或qRT-PCR即可确定，瞬转siRNA即可。

25、问：我最近在做RNAi，是找公司做的质粒载体，一共四个载体，转染后收集细胞提RNA做RT-PCR,但一个都没有起到干扰效果，这可以理解，但竟然公司的阳性对照是干扰的GAPDH也没有出现干扰效果，真的很费解，难道是我们的操作那里出错了吗？转染效果还好！

答：如果转染效率没有问题，阳性对照为阴性，说明：1.转染实验和操作没有问题。2.RT-PCR有结果，RT-PCR如果没有被污染，应该过程没有问题。3.质粒载体问题的可能性大。建议：只转阳性对照，进一步确定问题所在。

26、问：慢病毒介导RNA干扰基因的表达，稳转细胞如何筛选？有哪些方法？

答：RNAi稳转细胞筛选和通常DNA稳转细胞筛选是类似的，如带抗性标志，通过抗性药物筛选。

27、问：我用的是胰腺癌细胞，转染试剂为Fugene6，表达质粒为pcDNA6（其中克隆有一蛋白的cDNA），筛选抗生素为Zeocin。我先尝试的是瞬时转染，48小时后western blot检测，目的蛋白得到过量表达，而且重复性也不错。接下来加入Zeocin做稳定筛选，大约10天后得到抗性细胞进行western blot检测，但结果是该蛋白没有过量表达。我已经重复了3次，都是这个结果。

答：

1。你的蛋白对细胞有毒性作用，因此长期筛选后，高表达的细胞通通死亡。不太可能是转染试剂的毒性，因为fugene6吹嘘是目前毒性最小的转染试剂，而且毒性不可能这么持久。

2。整合效率，zeocin筛选能力以及过表达蛋白的丢失。

首先，顺转有，只表明你的转染操作没问题。稳转通常需要质粒和基因组重组，整合进去，所以也许整合效率太低。

其次，zeocin和G418这两种药物的作用都很缓慢，通常没个半个月，细胞基本不死，而且特别容易产生耐药细胞株，尤其肿瘤细胞；所以10天嘛，如果你给药剂量太低，和没给药差不多；而且多数细胞在这10天还会疯长，那么10天后也许你的细胞密到对药物高度耐受了（细胞之间有通讯作用）。所以通常是转染一个6孔板，40-48hr后，稀释到一个15cm dish，或者多个10cm dish，应“立即”加药不要等到细胞帖壁；当然你可以从更小的孔起始。如果这10天中，细胞有长满，还要再稀释。

再次，过表达蛋白对细胞是严重的负担，如果你出现“其次”中的现象，诸如细胞长满，那么过表达的细胞株会逐渐被同化，从高变中变低，直至质粒彻底丢失。我知道在读医的很多人认为蛋白表达量很高才叫过表达；实际上严格的说只要表达外源蛋白都叫过表达，过表达的概念是相对于原本内源性蛋白水平来说的。所以即使外源蛋白表达很低的过表达，也会丢失至不表达。

总之，你筛选10天后耐药株长了一堆，过表达的因为负担而产生的竞争劣势，被逐渐取代、同化，所以你失败了。如果你不改变你的实验方法还会失败。

记住从小孔起始转染，40-48hr后，消化到大板加药；同时，请重新摸索一下药物作用浓度。以14天完全杀死未转染的细胞为标准；最后，筛选的时候，加一个阴性对照，加药14天后，应该基本完全死光。

PS：我推荐给你的方法，不是筛选绝对单克隆细胞株的方法；但是在多数情况下更常用，因为通常没有这个必要，而且100%单克隆细胞株由于缺乏细胞间通讯，细胞生长缓慢，或者需要特殊操作（诸如添加饲养层细胞上清之类的操作），工作量大而繁琐。

如果你非要100%单克隆嘛，那就是消化后，将细胞大量稀释到能确保96孔板的每个孔只接种0.5-1个细胞的浓度，然后接种96孔板；接种以及后续培养操作非常非常繁琐，当然抗体公司或者制药公司通常是这么做的。

28、问：现在准备做癌干细胞RNA干扰前后的细胞生物学行为，是siRNA 还是shRNA 的效率好呢？

答：单就siRNA和shRNA干扰效率而言，没有区别；但是你要考虑到转染效率的问题；因为最终的效果=干扰效率转染效率各种操作造成的衰减。换种说法，shRNA可以用来筛选，可以保证100%细胞都是KD的，因此positive的结果会更明显。siRNA由于转染效率以及提高转染效率带来的细胞毒性等等会削弱或叠加实验结果，如果你的靶蛋白功能非常强大不可或缺，那么可能会有比较明显的差异；而且siRNA成本很高。

shRNA的缺点是，体内很多基因功能互补，那么一个功能非常重要的基因可能有多种互补的途径，经过长期筛选，表型衰减甚至无表型；但成本低廉，而且可以得到稳定的模型。

所以互有优劣，但通常首选是shRNA，siRNA多数用于应急或者互补的情况。

29、问：我最近要做大鼠肾脏某基因的体内干扰，不知道对于肾来说，哪种导入方式更有效？尾静脉注射、腹腔注射、或者肾动脉注射（有技术难度）？剂量也很难确定，国内外文献对肾脏的体内干扰比较少，头疼！

答：体内转染的干扰实验，确实较少，但一般做了，然后发表的文章级别都较高。科研的魅力正是这样，做的少，困难大，就更需要尝试、开拓、创新，得到的回报就是，发好文章，得到大家的认可。一般体内转染，如果做局部器官组织的实验，首选局部注射，这样局部给药浓度高，同时对其他器官组织影响较少，其次可以选择尾静脉注射，这种方法对肺、心血管、肝、肾等器官的效果也不错，同时也相对简单。英格恩有体内转染试剂，剂量问题具体你可以参考相关Protocol。

30、问：本人刚接触SiRNA技术，请问SiRNA 一定需要载体吗，如果不用载体，转染成功的细胞，传代培养以后，是否还保留基因沉默的特性。

答：siRNA在细胞内会逐步降解的，传一些代以后，siRNA被完全降解后，其沉默效应就没有了。要想长期保持沉默效应，2周到1个月的，可以采用构建shRNA载体的方法。

31、问：小弟现在准备做幽门螺旋杆菌的基因沉默，能否用rna干扰技术，查了很多文献，好像RNAi在细菌中机制不明啊，而且有的文献说细菌中没有RNAi现象，国外相关文章很少，国内寥寥几篇，感觉里面有些水分，请楼主给一个权威的观点，是否能做呢？

答：这个确实不明确，RNAi主要针对的还是真核生物，通过RNAi调控的都是复杂的转录后活动，像原核生物这种相对简单的转录机制，我想有一个简单的方法来看，先确定是否存在参与RNAi的蛋白和酶，如果没有相应的同源基因，估计有RNAi的可能性不大，如果有相应的同源基因，存在的可能性大一些。一般来说，从进化的角度来看，有的估计有，有的估计还真没有。

32、问：我现在构建了两个shRNA病毒包装载体。实验发现，当用此病毒感染我的稳定高表达目标基因的细胞株的时候，knockdown效果很好。但感染正常细胞后，目标基因的内源性表达水平几乎没有变化。请问这是为什么呢？

答：实际上，逆转录病毒载体存在的主要问题，是无法高效转导非分裂期细胞，所以对一些正常细胞转导效率不高。很多人认为，病毒对所有的细胞转导效率都很好，并不正确。病毒也是分细胞类型的。具体的病毒载体对具体的细胞效率怎样，可详细询问相应提供载体的公司。不管怎样，你需要确定转染是否成功。建议对正常细胞株采用阳性对照。看看转染过程是否有问题。

我的实验是要看某个基因的激活是否依赖某蛋白，因此既要转该基因的荧光素酶报告基因，又要转它所依赖蛋白的SiRNA将这个蛋白干扰掉，我的问题是：用WB检测到SiRNA 干扰蛋白的表达要48小时，而荧光素酶报告基因转染后24小时就可以了，我是不是要先转SiRNA，24小时后再转荧光素没报告基因？可是这样就要加两次lip2000，是不是对细胞毒性太大了？（文献报道那个蛋白6小时的半衰期）谢谢！

如果实验需要这样做2次转染，确实可能存在细胞毒性对实验的影响。如果是这样，可以考虑换一种低毒性转染试剂。

33、问：我从公司购买了带有载体的shRNA，所用的载体是pCMV，上面带有绿色荧光蛋白。做瞬时转染时候效果还不错，转染效率可以达到接近90%，干扰效率也挺高，可是稳定转染，并采用嘌呤霉素进行筛选2周后，再次用流式检测转染效率，已经下降到了不足30%，而且荧光显微镜下，表达绿色荧光蛋白的细胞数量也是星星点点。所以感到非常的不解，希望您予以帮助。注：所用的嘌呤霉素的浓度在之前已经摸索过，3天可以使不转染的细胞全部死亡，而且筛选过程中，全部采用了此浓度。

答：你的质粒应该是带嘌呤霉素抗性基因的吧？首先，这种筛选是有假阳性的，即有嘌呤霉素抗性,却不表达下游蛋白。有人认为，其原因是由于质粒整合入基因组是随机的过程，故常常会有不完全的整合，即，抗性基因整合并表达而目的基因丢失。

34、问：请教用慢病毒做载体转染，如何筛选稳定表达的单克隆细胞？

答：一般也是通过抗生素抗性来筛选。即慢病毒上带相应的抗性基因。

我所使用的SiRNA试剂是购买的商品化产品，不带荧光标签，那么转染效率只能通过RT和WB来验证是吗？

是的，没有荧光标记，如果需要确定转染效率，一般采用qRT-PCR和WB。

35、问：我下一步要做神经干细胞的RNAi，如果通过直接合成siRNA,再用转染试剂直接转的话，不知道效果怎么样？

答：神经干细胞的转染相对不易。但如果用转染试剂转染siRNA，干扰效率有40%就足够做实验了。

36、问：请问一下，做体内sirna实验，sirna的剂量一般如何确定呢？此外，in vivo jetPEI转染试剂，和你们的纳米转染试剂EntransterTM-in vivo转染试剂，哪一个较好，有没有相关的比较文献？

答：体内转染，siRNA的剂量和动物的大小以及注射部位还有基因等相关。如果采用我们的体内转染试剂，可以按照相关Protocol操作。关于和其他试剂的比较，公开发表相关数据其实是不正当竞争。

37、问：刚接触RNAi实验，想请教下，我的实验是细胞水平的，现在不知道是应该订购载体表达的shRNA还是小片段的siRNA?请问两种在转染效率和沉默时间等有什么区别？

答：根据您实验需要沉默的时间来确定是用shRNA还是siRNA，1周以内的短期抑制，采用siRNA较好，无需构建载体，节省时间，还可以采用2次转染的方法，延长RNAi作用的时间到2周。2周以上长效RNAi实验，采用shRNA表达载体较好，效应持续时间长，缺点的需要构建相关载体。效率上，根据具体细胞，实验情况，各有千秋。

38、问：我看资料说荧光标记阴性对照可用于优化转染条件和评价转染效率，我想请问一下：阴性对照应该是与目的基因的序列无同源性的，那如何评价转染效率？

答：带荧光的siRNA，不考虑序列，转染进去细胞内即可出现荧光，故可用于优化转染条件和评估转染效率。而沉默效率则和siRNA序列相关。

39、问：请教下，我在NCBI里查到的目的基因有3个mRNA,但是合成siRNA只能选择其中一条mRNA , 目前已有的文献也没有做这个的，我该如何选择呢？

答：3个mRNA可能至少产生3个蛋白，研究哪个蛋白就选和这个蛋白相关的mRNA，如果不产生蛋白，就根据独立的功能对应的mRNA来研究，如果是研究这个基因的全部功能，就分各个mRNA来分别研究。

40、问：siRNA转染细胞时需要控制在20－40%的融合度，那么转染后细胞增殖一两个周期或更长的时间后（一周之内吧），还能保证转染效率吗？

答：不是很明白你说的，我理解是二次转染的问题。如果需要二次转染，转染时仍然控制20-40%汇合度即可。只要细胞状态差不多，如果其他条件不变，就转染效率而言，第二次转染的效率不会下降多少。

41、问：最近也要做神经干细胞转染，另外想问一下，用RNase III制备小分子干扰RNA(siRNA)库来做RNA干扰，如何？看了些文章，很少有人用这个方法。

答：RNase III制备siRNA也是一种产生siRNA很好的方法。可能是由于需要自己制作长片断的RNA，同时用RNase III消化得到siRNA，方法上复杂一些，用的人少了。其实，这种方法产生的是siRNA库，没有序列设计的问题，相对粗一些，但比化学合成siRNA产生的沉默非特异性沉默少。如果不需要知道具体的siRNA沉默序列，只需快速要得到沉默的实验，这种方法还是不错。

42、问：我做siRNA转染hepG2细胞，按理说应该不难转染的，我用24孔板转染，体系A：加了1ul lipo2000和1ul siRNA，siRNA终浓度为20pmol，我转染后2.5个小时换液，同时以另一体系B:2ul lipo2000和2ul siRNA做对照，第二天用qPCR的方法检测转染效率，发现与NC相比，体系A的siRNA为NC的3倍多，而体系B仅为1.5倍。这种qPCR的方法能说明转染效率么，是不是确实该用荧光阴性对照siRNA来检测啊，我也做过A B两种体系转染后6小时换液的尝试，6小时后细胞死亡很多。

答：细胞死亡很多，应该是lipo2000的毒性。

qPCR是完全可以通过检测mRNA水平，来直接确定siRNA的干扰效率的。

但由于细胞毒性的存在，凋亡细胞的很多mRNA水平也是下调的，与干扰效果重叠，无法判断真实情况，这也就是为什么细胞毒性对RNAi实验很重要的原因。

确定转染效率大多通过带荧光标记的阳性对照来确定。