siRNA转染的相关问题解答

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随着基因与蛋白功能研究的深入，siRNA转染 已日渐成为实验室工作中经常涉及的基本方法。本文收录了与siRNA转染相关的常见问题，并附上QIAGEN专家的解答，希望能对您的实验有帮助。

Q：我该如何优化siRNA转染 ?

A：在实验室中建立RNAi和研究每一种新的细胞系时，应当优化siRNA的转染 。HiPerFect Transfection Reagent Handbook中包含优化的有用信息(www.qiagen.com/HB/HiPerFect)。在优化实验中，转染效率可通过阳性对照(如AllStars Cell Death Control siRNA)的转染来监控。

应当优化的转染 因素包括：

试剂和siRNA 的量

转染时的细胞汇合度

分析前细胞和复合物的孵育时间

Q：转染少量的siRNA为何很重要?

A：高浓度的siRNA转染可能产生脱靶效应，即siRNA影响了部分同源或非同源基因的表达。研究表明，可能会对RNAi实验产生误导结果的脱靶效应可通过降低siRNA浓度而在很大程度上避免(1,2)。HiPerFect Transfection Reagent有助于siRNA的高效吸收，实现了低浓度下的基因沉默，而不损害knockdown的效率。

Q：在siRNA转染过程中为何应当避免细胞毒性?

A：siRNA导入所引起的细胞毒性干扰了RNAi后的数据分析，因为表型分析不再可靠。影响数据分析的因素包括转染试剂所引起的表型改变，压力所引起的基因表达改变，以及不应当用于分析的死细胞的存在。

HiPerFect Transfection Reagent对细胞无毒性，不会引起液泡形成(这标志着细胞进程的破坏)。详细的细胞周期和细胞形态学分析显示mock转染的细胞(只有 HiPerFect Transfection Reagent)和未转染的细胞之间无差异。

Q：顺式转染和反式转染之间有什么差别?

A：在反式转染的步骤中，siRNA先加在平板的孔中，然后才是转染试剂。在复合物形成之后，加入细胞。顺式转染则相反，先在孔中加入细胞，然后才是复合物。反式转染使用广泛，特别对于高通量实验，因为它容易自动化，转染前siRNA可储存在孔中，且使用了较少的材料，因为不需要在一块单独的板上开展siRNA-转染试剂复合物的形成。

顺式转染	反式转染
第1步 细胞	第1步 核酸
第2步 转染复合物	第2步 HiPerFect Reagent
	第3步 细胞

参考文献：

1. Semizarov, D., Frost, L., Sarthy, A., Kroeger, P., Halbert, D.N., and Fesik, S.W. (2003) Specificity of short interfering RNA determined through gene expression signatures. Proc. Natl. Acad. Sci. USA 100, 6347.

2. Persengiev, S.P., Zhu, X., and Green, M.R. (2004) Nonspecific, concentration-dependent stimulation and repression of mammalian gene expression by small interfering RNAs (siRNAs). RNA 10, 12.

本文翻译自QIAGEN公司的《Flexible RNAi Technologies You Can Rely On》。