化学发光检测原理

概述

化学发光作为一种分析工具的吸引之处就在于检测的简单性。化学发光的实质是自身发光，这意味着化学发光的分析测试仪器只需要提供一种可以检测光信号和纪录结果的方法就可以了。自发光检测仪需要一个闭光的样品室和光检测器。最简单的便是相片纸或X光片，甚至视觉检测器都可以。

化学发光检测方法的简单性使得它的应用很简单并且完全可以自动化。但是它的灵敏度又是怎么样的呢？化学发光有如下两个内在的优势：

1．绝大多数的样品没有“背景”信号，如它们自身不发光。

2．化学发光的检测不是一个比例测试，这是与荧光和吸收或比色测试不同的。在荧光测试中，具有小的Stokes Shift的荧光基团非常难检测。荧光很难从激发波长中分辨出来。

另外一个问题是，特别在样品是浑浊的情况下有一部分杂光会进入到检测器。

在吸收光测试上，其灵敏度受到限制的根本因素是需要在两个相对较强的信号之间去区分一个较小的差别。

需要注意的是检测器对光谱的敏感性近可能接近化学发光的光谱，以得到最大化的灵敏度。一般在自发光仪中的光电倍增管对蓝光有最佳的反应，对红光的末端光谱不太敏感。固态检测器对红光有较好的反应。

X光片广泛用于记录在尼龙膜、纤维素膜或PVDF膜上的化学发光印迹分析。但是我们需要牢记在心的是X光片仅能够用于检测紫外到蓝光光谱范围内的光信号，虽然有一些特殊的光片对增强的绿光有敏感性。

液体样品的检测

有一些特定的词来描绘化学发光检测：灵敏度、线性和动态范围。每一个词的意义如下：

1．灵敏度指的是某种东西可靠检测的最低水平。“某种东西”是指在一个分析测试中的测试物。测试物是被标记了一种可检测的东西，如化学发光化合物或的一种酶。分析物也可以是一种通过与具有标记的亲合物有特异性结合反应而检测的物质。所谓的可靠检测指的是针对一个空白测试样品，检测器能够重复感应到最低水平的信号，而这种信号是由所检测物本身产生的。

2．线性描述的是信号与分析检测物浓度范围之间的关系。理想的比例因子是常数；信号点与分析检测物是一条直线关系。标准曲线可以不是直线，如s形，仍是有用的。

3．动态范围指的是被检测物浓度与信号单一模式的变换范围。它定义的是分析的工作范围。

你期望通过化学发光得到什么水平的灵敏度呢？答案不一定会满足你的要求，“它是有条件的”。在很少情况下，检测器的灵敏度或化学发光方法会是检测的局限因素。现在的检测器可以达到很高的灵敏度。大多数情况下，而是其它的一些因素显示了分析检测的灵敏度。最通常的是生物成分（抗体、酶等）的非特异性结合到反应容器和支持物的表面。例如，免疫分析，印迹实验，核酸杂交和其它的酶联结合实验都是受制于此因素。

管和微孔板

玻璃、透明或半透明的塑料管、比色皿是化学发光测试比较理想的材料。理想的是光能够通过一个平面然后测试，以减少边际效应。曲面也可以使用，如圆柱型的测试管。用不同的测试管测试比较结果，这些管必须是统一生产的，才可以比较结果。

微孔板——从化学发光反应中发射出的光是各向同性的，即在各个方向上同等发射出来的。如果一个化学反应是在透明的微孔板中的微孔中进行，光不仅从垂直方向发散，还从水平方向发散出来。光很容易的通过各个孔之间的间隙和孔壁。光较强的孔就会干扰相邻的孔。因此，化学发光测试一般不用透明微孔板。

不透明的微孔板和板条主要有两种——白色和黑色。使用者需要注意的是黑色的因为有光吸收，所以它的信号会比白色板有很明显的减弱（将近10倍）。因为所有的孔是同等比例的收到影响，所以不管他们的强度，定量并没有问题。白色或黑色板的选择，主要是基于预期检测信号的强弱，白色板用于检测较弱光的检测，黑色板用于检测强光的检测。黑色板的另一优点就是可以削弱非特异性结合所带来的问题。

此外，白色板并不是完全同等不透明。为荧光设计的白板的白色素比用于化学发光的白板的要少的多。在荧光检测时，每检测一次，一般在针对一个孔，消除了相邻孔之间的干扰。白色微孔板的好坏很容易检测，只要在板的后面放上一只灯，然后看每个孔。如果穿过的灯光不仅仅是淡淡的，那么用于较强的化学发光底物的分析是会有一些问题的。

固相样品的检测（印迹膜）

X光片——它已经被认为是对固定在膜上的蛋白或核酸进行化学发光检测的强有力的工具，如Southern、Northern和Western杂交的化学发光检测。此类商业化的产品已非常广泛。

如果能够控制好非特异性的结合，灵敏度是足够的。如果不能很好控制，将会X光片上曝光过度。解决这个问题的最好策略是减少结合的试剂的量，例如抗体或类似物。曝光时间1到10分钟通常是足够显现大多数的印迹。更长的很少能提高信号/背景。

关于灵敏度相对的方面来讲，未得到信号并不意味着分析物的不存在。任何一种光学用膜片都有一个强度阈值，在这个阈值之上银颗粒的光化学转化才能成功。否则会失败，称之为“可逆失败”。在实际操作中，化学发光信号低于阈值强度的结果仅是简单的没有记录。更长时间的曝光也不能克服这个问题。可以通过一些方法来改进，在曝光之前如把膜片放在氢气和氮气的混合气体中预闪，即用低强度的光短时间的照射膜片，以提高光学颗粒的光子。

CCD成像技术——最近，基于CCD的影像系统已成为化学发光印迹结果获得和记录的好工具。这些系统在信号测试的动态范围上表现出很好的效果。CCD的量度大小为3～4个级数，而X光片仅为1个级数。摄像时间短，并且可以获得多个影像和容易存储。虽然需要投入设备的购置费，但是可以节省膜片和其它的投入。

设备（光电倍增管）

在发光仪上，PMT为传统的选择。它们的优势包括良好的灵敏度，宽广的动态范围和较宽的光谱相应。因为PMT具有很低的暗电流，使得它们具有极佳的信噪比。

PMT有两种基本模式——单光子计数和电流感应。有些复合系统是在每秒百万个光子以下为单光子模式，超过之后为电流感应。

PMT单光子计数系统是超灵敏的。用这类检测器主要是为了满足灵敏度要求较高的测试和定量。越高要求的灵敏度，价格越高。样品测试室必须是光密闭性非常好的。如果光太强会损害PMT。

PMT电流感应系统也能获得较好的灵敏度，经常用于比单光子计数系统检测的更强的光。

对于选择何种模式的PMT检测器，需要与你的实际需要结合起来选择。现在，这两种检测器的化学发光仪操作都比较简单，灵敏度也都比较好。对此有一个正确的理解，你就可以选择一个比较适合你的应用的设备。

PMT主要应用在液相中化学发光的检测，仪器形式可以为管式和板式。其检测结果单位值为RLU（Relative Light Unit），各个公司生产的产品其对RLU的定义会有所不同。

固态检测

光电二极管能够感应比光电倍增管所感应的更强的光强度。对于那些需要测试高强度光的应用，选择这样的检测器比较好。然而，固态检测器的暗电流比光电倍增管一般要高很多。解决这个问题的方法之一是通过Peltier或者是其它的热电制冷设备冷却固态检测器。在0～30摄氏度范围内，固态检测器的暗电流随温度的降低会急剧下降。冷却的检测器能够整合1到100秒范围内所检测到光信号而不会被暗电流所覆盖。

CCD和其它的固态检测器拥有以下几个内在的优点：

1、在可见光谱范围内，固态检测器有一个较好的光谱响应。发光反应发出红光，甚至近红外光。

2、CCD影像系统可以对不同的目标物进行检测。基本上任何一种样品或容器都可以适用，如微孔板，细菌测试管或细胞培养皿，电泳凝胶和印迹膜。

3、单个PMT系统在测读之前必须对样品位置进行定位。样品管重复多次带到一个固定位置，然后重复测读。微孔板PMT测读仪依赖于微孔之间的标准间隔，能够按照一个预算好的位置移动微孔板，由此微孔一个接着一个的测读。而摄像系统测读一个样品不需要预先知道它的位置，例如膜上的一个条带。影像系统能够把样品的浓度和位置信息给出。

4、CCD影像系统能够同时获得大量样品的信息。如对96、384或更多数目的微孔板的数据的同步收集并不是一个奢望。固态影像系统可以一次就获得整个微孔板的影像和定量。

仪器设计者或终端使用者需要注意的是影像检测器对于微孔板样品的检测存在一个重大的缺陷：三维的微孔板相比于二维检测物（如膜）会产生一个边际效应。因为光强度按照距离平方的倒数逐渐变弱，所以把摄像头放到尽可能离板近的地方由此可以得到最好的结果。然而，因为孔是有深度，最远孔的整个底部就可能看不到。这个孔的边缘部分的光信号就很可能检测不到。

提高摄像头将削减检测器所获得的整体的光强度。几何计算模式可以拿来应用以弥补边际强度的丢失，但是外围孔的信噪比必然比中央孔的要差。

CCD应用最普遍的设备系统为带制冷CCD的化学发光凝胶成像系统。为了提高检测速度和通量，有时也把CCD应用到高通量的板式化学发光检测仪上。

辅助设备

大多数研究用的发光仪和发光免疫分析仪都装有一些辅助装置，如样品孵育，样品注射器，光学滤光片等。

1.、温度控制——有时需要的结果进行比较，会因为温度的不同而收到干扰。特别是在一些酶催化的“glow”型的反应需要几分钟才能达到高峰，温度的变化会导致测试到的强度发生变化，降低分析的精确性。如果能够控制样品的温度和反应温度的统一，可以使得反应在固定条件下进行。样品发光强度可能由几个因素造成的：温度依赖的酶动力学和随后的底物化学反应动力学。缓冲液的pH值加上温度的影响可以引起信号的显著变化。

2、单色分光和滤光片可以分离特定的波长或光谱范围的光。在化学发光应用中一般没有特殊的要求，它们是不需要的。在同一个反应体系中有两种能够发出不同光谱的发光物，其目的是为了分析检测两种不同的测试物。如在生物化学发光能量共振转移中，就用滤光片来分析蛋白质的相互结合。波长的选择不免会降低检测器上的光通过量从而倒是灵敏度的损失。

3、中性滤光片——使用中型滤光片可以是检测设备的检测范围延伸2～3个数量级。由特制的浅灰玻璃组成，放置于样品与监测器之间，这些滤镜起到类似“太阳镜”的作用将所有波长的光都以相同的因子进行减弱。使用此校正因子将测量得到的光校正到“真实”的强度。

4、注射器可以使得底物或启动剂能够以精确的时间加入。对于一个随时间光信号产生变化的动力学样品来说，这是非常重要的。