质粒构建之酶切位点的选择

丁香园2014-04-08

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结论：一定要选择具有相同buffer的两个酶

技术背景：

克隆目的基因，并把其装入表达载体转化/转染原核细胞/真核细胞中，是获取目的蛋白/研究基因功能的经典方法，也是目前科研工作者常用的方法。其中酶切是该技术不可缺少的一部分，随着载体设计技术的发展，双酶切以其独特的优点而逐渐取代了单酶切。

具体实验流程如下：

设计合成含有酶切位点，能扩增基因ORF全长的一对引物——PCR扩增目的基因——纯化PCR产物——分别对PCR产物及载体进行双酶切——分别纯化双酶切产物——连接目的基因与载体——转化大肠杆菌——筛选阳性克隆——质粒提取——转化/转染——获得重组蛋白/功能研究

酶切反应虽然是在PCR之后，但是酶的选择却是在PCR前引物设计时就完成了。我觉得这就是错误的根源！

故事：导师给我的第一个课题就是研究病毒包膜蛋白的功能，首先我需要克隆出该基因，并把它装入真核表达载体pcDNA3.1(+)，构建重组质粒。根据pcDNA3.1(+)载体多克隆位点的内切酶排列顺序，在设计引物时，我在上下游引物的5'端分别引入两个常用的便宜得内切酶：BamHI/XhoI。引物送公司合成后，就开始实验：PCR过程非常顺利，一下就把目的基因拉出来了。但是怎么也想不到，这个载体我忙了半年也没有构建成功。由于PCR后面的酶切，连接，转化试验都无法进行成功性的鉴定，试验只有拿单克隆细菌进行鉴定。可是我的平板上始终看不到有单克隆生长。所以错误可能出现在PCR后的任何一个环节。

下一步就是要找出错误发生在哪里！最容易的鉴定就是感受态细胞了，拿载体做了一个阳性对照，结果板上密布菌落。这说明感受态细胞以及转化的过程没有问题。

那问题很有可能出在两个地方：1.双酶切没有完全切开 2.连接没有成功！由于师兄用同样的两个酶有成功的先例，所以我主观判断是连接出了问题！判断的失误导致我浪费半年的时间：购买新的T4连接酶，不停的摸索连接条件，不停的更换目的基因与载体的比例，应用平端连接的连接体系.......半年时间就在痛苦的重复和思索中过去了。老板不得已给我更换了课题！后来实验室又要构建重组质粒，由于我“经验丰富”，老板把这个重任又交给了我。这次在设计引物时，无意中我更换了酶切位点（目的序列中含有XhoI的序列，不可用），选用HindIII/BamHI。实验结果出奇的顺利，两个星期内我就把测序鉴定正确的质粒大提后交给老板！

我反思：为什么我做了半年没做出来，而这次半月就搞定了呢，极有可能使酶切的问题：BamHI/XhoI没有共同的buffer，不管加入哪一种buffer，都有一种酶的活性只有50~70%，而HindIII/BamHI却有着共同的buffer，在双酶切体系中两个酶的活性都达到100%。

为了证明这一设想，我又重新设计引物，选用HindIII/BamHI这两个酶，结果被我一举拿下这个重组质粒！

之后，老板把实验室所有重组质粒的构建任务都交给了我，两年内我成功构建了8个重组质粒。