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DNA的琼脂糖凝胶电泳

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20041

带电荷的物质在电场中的趋向运动称为电泳。电泳的种类多,应用非常广泛,它已成为分子生物学技术中分离生物大分子的重要手段。琼脂糖凝胶电泳由于其操作简单、快速、灵敏等优点,已成为分离和鉴定核酸的常用方法。

实验目的:掌握琼脂糖凝胶电泳的原理,学习琼脂糖凝胶电泳的操作。

实验材料:质粒DNA、BAC、植物总DNA或它们的酶切产物。

实验原理:在pH值为8.0~8.3时,核酸分子碱基几乎不解离,磷酸全部解离,核酸分子带负电,在电泳时向正极移动。采用适当浓度的凝胶介质作为电泳支持物,在分子筛的作用下,使分子大小和构象不同的核酸分子泳动率出现较大的差异,从而达到分离核酸片段检测其大小的目的。核酸分子中嵌入荧光染料(如EB)后,在紫外灯下可观察到核酸片段所在的位置。

实验步骤:

(1)用胶带将洗净、干燥的制胶板的两端封好,水平放置在工作台上;

(2)调整好梳子的高度;

(3)称取0.24 g琼脂糖于30 ml 0.5×TBE中,在微波炉中使琼脂糖颗粒完全溶解,冷却至45-50ºC时倒入制胶板中;

(4)凝胶凝固后,小心拔去梳子,撕下胶带;

(5)将电泳样品与溴酚蓝混合后将样品依次点入加样孔中;pUC18 5µl ddH2O 3µl 溴酚蓝2µl 共10µl于0.5ml tube中混合后点样;

(6)将制胶板放入电泳槽中,加入电泳液,打开电泳仪,使核酸样品向正极泳动;

(7)电泳完成后切断电源,取出凝胶,放入0.5 µg/ml的溴化乙锭(EB)溶液中染色10-15 min,清水漂洗后置于紫外透射仪上观察电泳结果,并照相记录。

附注:

1.影响DNA在琼脂糖凝胶中迁移速率的因素:

(1)DNA分子大小 迁移速率U与logN成反比(N为碱基对数目)。分子大小相等,电荷基本相等(DNA结构重复性)。分子越大,迁移越慢。等量的空间结构紧密的电泳快(超螺旋>线性DNA)。

(2)琼脂糖浓度:logU=logU0 Krt 胶浓度,U为迁移率,U0 为DNA的自由电泳迁移率,t为胶浓度,Kr为介质阻滞系数。不同的凝胶浓度,分辨不同范围的DNA 。Agarose: 0.5%: 1-30 kb; 0.7%: 0.8-12 kb ;1.2%: 0.4-7 kb; 1.5%: 0.2-3 kb.。

(3)DNA构象:一般迁移速率超螺旋环状>线状DNA>单链开环。当条件变化时,情况会相反,还与琼脂糖的浓度、电流强度、离子强度及EB含量有关。

(4)所加电压:低电压时,线状DNA片段的迁移速率与所加电压成正比。使分辨效果好,凝胶上所加电压不应超过5V/cm 。

(5)碱基组成与温度:一般影响不大4 -30 ℃ 。

(6)嵌入染料的存在:降低线性DNA迁移率,(不提倡加在电泳液中)。

(7)电泳缓冲液 (0.5×TBE)的组成及其离子强度影响DNA的迁移率,无离子存在时,核酸基本不泳动,离子强度过大产热厉害,熔化凝胶并导致DNA变性,一般采用1×TAE,1×TBE,1×TPE(均含EDTA pH8.0)。

2.溴化乙锭(EB)为致癌剂,操作时应戴手套,尽量减少台面污染。

3.电泳指示剂:核酸电泳常用的指示剂有两种,溴酚蓝(bromophenol blue,Bb)呈蓝紫色;二甲苯晴(xylene cyanol,Xc)呈蓝色,它携带的电荷量比溴酚蓝少,在凝胶中的的迁移率比溴酚蓝慢。

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