DNA的琼脂糖凝胶电泳

带电荷的物质在电场中的趋向运动称为电泳。电泳的种类多，应用非常广泛，它已成为分子生物学技术中分离生物大分子的重要手段。琼脂糖凝胶电泳由于其操作简单、快速、灵敏等优点，已成为分离和鉴定核酸的常用方法。

实验目的：掌握琼脂糖凝胶电泳的原理，学习琼脂糖凝胶电泳的操作。

实验材料：质粒DNA、BAC、植物总DNA或它们的酶切产物。

实验原理：在pH值为8.0~8.3时，核酸分子碱基几乎不解离，磷酸全部解离，核酸分子带负电，在电泳时向正极移动。采用适当浓度的凝胶介质作为电泳支持物，在分子筛的作用下，使分子大小和构象不同的核酸分子泳动率出现较大的差异，从而达到分离核酸片段检测其大小的目的。核酸分子中嵌入荧光染料（如EB）后，在紫外灯下可观察到核酸片段所在的位置。

实验步骤：

（1）用胶带将洗净、干燥的制胶板的两端封好，水平放置在工作台上；

（2）调整好梳子的高度；

（3）称取0.24 g琼脂糖于30 ml 0.5×TBE中，在微波炉中使琼脂糖颗粒完全溶解，冷却至45-50ºC时倒入制胶板中；

（4）凝胶凝固后，小心拔去梳子，撕下胶带；

（5）将电泳样品与溴酚蓝混合后将样品依次点入加样孔中；pUC18 5µl ddH2O 3µl 溴酚蓝2µl 共10µl于0.5ml tube中混合后点样；

（6）将制胶板放入电泳槽中，加入电泳液，打开电泳仪，使核酸样品向正极泳动；

（7）电泳完成后切断电源，取出凝胶，放入0.5 µg/ml的溴化乙锭（EB）溶液中染色10－15 min，清水漂洗后置于紫外透射仪上观察电泳结果，并照相记录。

附注：

1．影响DNA在琼脂糖凝胶中迁移速率的因素：

（1）DNA分子大小 迁移速率U与logN成反比（N为碱基对数目）。分子大小相等，电荷基本相等（DNA结构重复性）。分子越大，迁移越慢。等量的空间结构紧密的电泳快（超螺旋>线性DNA）。

（2）琼脂糖浓度：logU=logU0 Krt 胶浓度，U为迁移率，U0 为DNA的自由电泳迁移率，t为胶浓度，Kr为介质阻滞系数。不同的凝胶浓度，分辨不同范围的DNA 。Agarose： 0.5%： 1-30 kb； 0.7%： 0.8-12 kb ；1.2%： 0.4-7 kb； 1.5%： 0.2-3 kb.。

（3）DNA构象：一般迁移速率超螺旋环状>线状DNA>单链开环。当条件变化时，情况会相反，还与琼脂糖的浓度、电流强度、离子强度及EB含量有关。

（4）所加电压：低电压时，线状DNA片段的迁移速率与所加电压成正比。使分辨效果好，凝胶上所加电压不应超过5V/cm 。

（5）碱基组成与温度：一般影响不大4 -30 ℃ 。

（6）嵌入染料的存在：降低线性DNA迁移率，(不提倡加在电泳液中)。

（7）电泳缓冲液 （0.5×TBE）的组成及其离子强度影响DNA的迁移率，无离子存在时，核酸基本不泳动，离子强度过大产热厉害，熔化凝胶并导致DNA变性，一般采用1×TAE，1×TBE，1×TPE（均含EDTA pH8.0）。

2．溴化乙锭（EB）为致癌剂，操作时应戴手套，尽量减少台面污染。

3．电泳指示剂：核酸电泳常用的指示剂有两种，溴酚蓝（bromophenol blue,Bb）呈蓝紫色；二甲苯晴（xylene cyanol,Xc）呈蓝色，它携带的电荷量比溴酚蓝少，在凝胶中的的迁移率比溴酚蓝慢。