比一比 谁能做更好的荧光定量PCR

PCR无疑是目前最常用的实验室技术之一，而由PCR发展出来的定量PCR技术，不单有PCR的快速灵敏，还以专一性更高、可实时监控、可重复精确定量等优势而日益受到重视，越来越广泛应用于科研、检验、和诊断领域。比如像近期蔓延的猪流感之类的具有潜在高度危险的传染病等就需要快速和准确地判断病源和发展趋势，而定量PCR技术正好会逢其适，以其准确和快速的优势在各重要部门得到了广泛的采用。

目前市场上定量PCR技术相关的产品琳琅满目，但大家熟悉的主要是一些国际知名品牌，其实国内许多自主研发的产品近年来也获得了长足的发展，比如BioTeke公司的荧光定量系列产品就以其优良的品质和亲民的价格越来越受到国内用户的青睐，目前还可以申请试用装。

为了证明其荧光定量系列产品的品质，BioTeke公司特邀请了山东大学细胞发育遗传学实验室进行了BioTeke的SYBR GREEN I实时荧光定量产品和T公司的实时荧光定量试剂的比对实验。具体实验如下：

实验材料

小鼠肝脏组织

山东大学实验室提供样品cDNA

实验方法

RNA提取：Bioteke RNApure高纯总RNA提取试剂盒，操作步骤请参考说明书。

目的基因：小鼠管家基因β–actin,山东大学提供样品基因。

cDNA制备：测定小鼠肝脏总RNA浓度后，使用BioTeke Super RT Kit 制备20μl cDNA.操作步骤参照试剂盒说明书。

一步法荧光定量PCR：

Bioteke One-step SYBR real-time RT-PCR Kit

20μl反应体系包括：

10μl 2×One-step SYBR premixture，7.2μl RNA Free Water，0.4μl Primer F，0.4μl Primer R，1μl cDNA，1μl One-step RT。

二步法荧光定量PCR：

小鼠肝脏组织Bioteke 2×SYBR real-time PCR premixture Kit。 T公司荧光定量试剂。

20μl反应体系包括：10μl 2×SYBR premixture,8.2μl RNA Free Water，0.4μl Primer F，0.4μl Primer R，1μl cDNA。

T公司荧光定量试剂，20μl反应体系包括：10μl 2×T公司荧光定量试剂， 8.2μl RNA Free Water，0.4μl Primer F，0.4μl Primer R，1μl cDNA。

山东大学提供样品Bioteke 2×SYBR real-time PCR premixture Kit。

T公司荧光定量试剂，20μl反应体系包括：10μl 2×SYBR premixture ，4μl Primer F，4μl Primer R，2μl cDNA。 T公司荧光定量试剂，20μl反应体系包括：10μl 2×T公司荧光定量试剂， 4μl Primer F，4μl Primer R，2μl cDNA。

反应程序：95℃ 2min， 95℃ 10sec，60℃ 15sec，40个循环。

实验结果

用小鼠肝脏组织RNA直接进行一步法荧光定量PCR；RNA经反转录成cDNA后分别用BioTeke试剂和T公司试剂同时进行两步法荧光定量PCR结果如图1。

两公司试剂同时在小鼠肝脏组织通过两步法荧光定量PCR试剂扩增和山大实验室所提供cDNA及引物扩增结果如图2。扩增的小鼠肝脏样品熔解曲线较差，而山东大学实验室所提供的cDNA和引物进行的扩增则完好。原因为由于长途携带引物和cDNA，保护措施不佳，造成引物和cDNA部分降解。

小鼠肝脏组织RNA经提取后直接用Bioteke One-step SYBR real-time RT-PCR Kit 进行荧光定量PCR后，结果如图3。

实验结论

经过不同样品的扩增后，可以看出BioTeKe公司的2×SYBR real-time PCR premixture Kit比T公司的荧光定量PCR试剂具有较高的扩增效率，在荧光值和灵敏度方面也有巨大的优势。另BioTeke公司的一步法Real-time PCR试剂盒也拥有很好的扩增效果。

同时，为了进一步证明BioTeke的实时荧光定量产品的质量，BioTeke公司在相同的模板、引物和反应体系下，用ABI7000荧光定量PCR仪也进行了其荧光定量产品和国际知名厂家A品牌，以及T品牌相关产品的对比实验。

实验材料

小鼠肝脏组织

实验方法

RNA提取：BioTeke RNApure高纯总RNA提取试剂盒，操作步骤请参考说明书。

目的基因：小鼠管家基因β–actin

cDNA制备：测定小鼠肝脏总RNA浓度后，使用BioTeke Super RT Kit 制备20μl cDNA.操作步骤参照试剂盒说明书。

二步法荧光定量PCR：

小鼠肝脏组织BioTeke 2×SYBR real-time PCR premixture Kit。

20μl反应体系包括：10μl 2×SYBR premixture，8.2μl RNA Free Water，0.4μl Primer F，0.4μl Primer R，1μl cDNA。

A品牌定量PCR试剂，20μl反应体系包括：

10μl 2×A品牌定量PCR试剂， 8.2μl RNA Free Water，0.4μl Primer F，0.4μl Primer R，1μl cDNA。

T品牌定量PCR试剂 ，20μl反应体系包括：

10μl 2×T品牌定量PCR试剂， 8.2μl RNA Free Water，0.4μl Primer F，0.4μl Primer R，1μl cDNA。每份试剂三管重复。

反应程序：95℃10min，95℃ 15sec，61℃ 31sec，40个循环。

实验结果

小鼠肝脏组织RNA经反转录成的cDNA分别用BioTeke公司试剂、A公司试剂和T公司试剂同时进行两步法荧光定量PCR扩增结果如图1。

 

从两个公司试剂的扩增曲线（图1a）中可以看出，在相同的模板情况下BioTeke 2×SYBR real-time PCR premixture Kit试剂的Ct值最小，T公司的Ct值次之， A公司的Ct值最大。同时，BioTeke 2×SYBR real-time PCR premixture Kit试剂的荧光值最高，T公司的荧光值次之， A公司的荧光值最低。说明，BioTeke 2×SYBR real-time PCR premixture Kit具有高的扩增效率。从熔解曲线（图1b）可以看出，A公司试剂和T公司实际熔解曲线峰值较低，也同样表明扩增效率较低。另三个公司试剂的熔解曲线特异性较差，引物需重新设计。

实验结论

经过相同样品的扩增后，可以看出BioTeke公司的2×SYBR real-time PCR premixture Kit是三家公司中扩增效率最高的，比A公司的荧光定量PCR试剂具有更高的扩增效率，这些实验数据说明BioTeke公司的试剂达到了国际领先水平。